大黄鱼slitrk3基因启动子克隆及转录调控分析.pdf
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1、DOI:10.12131/20220309文章编号:2095 0780(2023)04 0068 09大黄鱼 slitrk3 基因启动子克隆及转录调控分析周锐涛,岳珠峰,纪焦军,温 靖,姜 丹,王志勇,方 铭集美大学 水产学院/农业农村部东海海水健康养殖重点实验室,福建 厦门 361021摘要:神经突触相关蛋白Slitrk3具有调节抑制性突触发育的作用。研究大黄鱼(Larimichthys crocea)神经突触黏附分子slitrk3基因的转录调控机制,可为解决大黄鱼养殖面临的生长、应激及抗逆等问题提供新思路。通过生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3氨基酸进行多重序列比对和系统进化
2、树分析,并预测大黄鱼slitrk3基因启动子区域相关的调控元件,采用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼slitrk3基因启动子区域的转录活性。生物信息学分析结果显示,Slitrk3氨基酸序列在鱼类中具有较高的保守性;大黄鱼slitrk3基因启动子区域预测存在2个潜在的转录起始位点、2个CpG岛以及Sp1、GR、C/EBP和C/EBP等多种转录因子结合位点。双荧光素酶报告基因系统结果显示,大黄鱼slitrk3基因启动子区域的19701614 bp、1210667 bp存在正调控元件,16141210 bp、667376 bp、376147bp存在负调控元件,推测147+16 bp为核心启动子。关键
3、词:大黄鱼;slitrk3 基因;启动子;转录调控中图分类号:S 917.4文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Cloning and transcriptional regulation of slitrk3 gene promoter in largeyellow croaker(Larimichthys crocea)ZHOU Ruitao,YUE Zhufeng,JI Jiaojun,WEN Jing,JIANG Dan,WANG Zhiyong,FANG MingFisheries College of Jimei University/Key Laborator
4、y of Healthy Mariculture in the East China Sea,Ministry of Agriculture and RuralAffairs,Xiamen 361021,ChinaAbstract:Slitrk3,a neurosynaptic-related protein,can regulate the development of inhibitory synapses.To explore the tran-scriptional regulation mechanism of slitrk3 gene of the large yellow cro
5、aker(Larimichthys crocea)can provide a new idea forsolving the problems of growth,stress and anti-stress in the L.crocea culture.We conducted a multiple sequence alignment anda phylogenetic tree analysis of amino acids for Slitrk3 in L.crocea and other species to investigate the transcriptional regu
6、lationmechanism of the neural cell adhesion molecule for slitrk3 gene.Besides,we predicted the potential core promoter regions,CpGislands and transcription factor binding sites of slitrk3 gene by bioinformatics methods,and detected the Luciferase activity ofpromoter of slitrk3 gene by the Dual-Lucif
7、erase Reporter System.Bioinformatics analysis shows that the amino acid sequences ofSlitrk3 were highly conserved in fish.There were two transcription start sites,two CpG islands,and multiple transcription factorbinding sites such as Sp1,GR,C/EBP and C/EBP in promoter of slitrk3 gene.Dual-Luciferase
8、 Reporter System shows that theregions from 1970 to 1614 bp and from 1 210 to 667 bp contained positive regulatory elements;while the regions from 1614to 1210 bp,from 667 to 376 bp and from 376 to 147 contained negative regulatory elements;and the regions from 147to+16 bp might be core promoter of s
9、litrk3 gene.The results lay a theoretical foundation for the further study of transcriptional第 19 卷第 4 期南 方 水 产 科 学Vol.19,No.42023 年 8 月South China Fisheries ScienceAug.,2023收稿日期:2022-12-04;修回日期:2023-02-27基金项目:国家重点研发计划项目(2018YFD0901201)作者简介:周锐涛(1998),男,硕士研究生,研究方向为水产动物遗传与育种。E-mail:通信作者:方铭(1979),男,教授,
10、博士,研究方向为水产动物遗传与育种。E-mail:regulation mechanism of slitrk3 gene in L.crocea.Keywords:Larimichthys crocea;slitrk3 gene;Promoter;Transcriptional regulationSlitrk3 是 Slitrk 家族成员之一,Slitrk 家族目前在哺乳动物中共发现 6 名成员,分别为 Slitrk1Slitrk6,该家族主要参与控制神经突起的生长1。Slitrk 家族的结构包含 2 个富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat,LRR)结构域和 1 个羧
11、基端酪氨酸残基结构域,因其两者保守结构域与轴突导向因子 SLIT 和神经营养因子受体 NTRK 高度同源而被命名为 Slitrk2。不同种类的 Slitrk 蛋白对神经突起生长有不同作用。Slitrk1 能够促进神经突起的生长发育,而 Slitrk2 则会抑制其生长3;Slitk3Slitrk6 广泛分布于脑组织的不同部位,可能协同Slitrk1 和 Slitk2 调节脑不同区域神经细胞的分化和神经突起的生长4。Slitrk3 作为突触后黏附分子,通过与轴突受体酪氨酸磷酯酶(Receptor tyrosinephosphatases,RPTP)相互作用,进一步调节抑制性突触发育,对正常功能性-
12、氨基丁酸能神经元(GABAergic neurons)突触发育具有重要作用5。slitrk3基因在斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎中的大脑增殖区和视网膜上均有表达,研究表明其在细胞增殖、迁移以及新神经元的诞生中发挥功能性作用6。-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)是一种能够介导突触传递、调节神经网络发育的关键抑制性神经递质7,其具有降血压、镇痛、抗焦虑以及抗癫痫等生物活性8。同时,GABA 在鱼类生长、抗氧化能力、应激反应、免疫功能等方面发挥重要作用9-11。大黄鱼是我国目前养殖规模最大的海水鱼类,但在养殖过程中,其对操作胁迫的应激反应相当敏感和激烈,
13、剧烈的应激反应不利于其生长及抗逆。因此,研究 slitrk3 基因的转录水平可为解决大黄鱼养殖所面临的生长、应激及抗逆等问题提供一种新思路。转录水平的调控是基因表达过程中最重要、最复杂的环节。启动子通常是一段位于结构基因 5端上游区的 DNA 序列,能够激活 RNA 聚合酶,使之与模板 DNA 准确地结合并具有转录起始的特异性。核心启动子通常为能够准确指导 RNA 聚合酶启动转录的最小 DNA 序列12,其被认为是复杂基因表达网络中的重要调控模块13。转录因子是一组可直接或间接与顺式作用元件结合并调控基因转录效率的蛋白14。目前 slitrk3 基因在哺乳动物中的研究较多,而鱼类 slitrk
14、3 基因的转录水平研究鲜有报道。因此,为了深入探究鱼类 slitrk3 基因的转录调控机制,本研究以大黄鱼(Larimichthys crocea)为实验材料,对大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化树分析,通过预测大黄鱼slitrk3 基因潜在的转录起始位点、CpG 岛和转录因子结合位点,推测其对启动子活性的影响;构建大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的重组载体并测定转录活性,确定启动子区域内的转录调控元件,为更好地阐明大黄鱼 slitrk3 基因的表达调控机制提供理论依据。1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用大黄鱼来自宁德市官井洋大黄鱼养殖
15、有限公司;DH5 Competent E.coli Strain 购自南京诺唯赞生物科技有限公司;HEK293T 细胞为本实验室保存。1.2 主要试剂琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、无内毒素质粒小量提取试剂盒均购自北京天漠科技开发有限公司;DNA 提取试剂盒(FastPure Cell/Tissue DNAIsolation Mini Kit)、高保真酶(2 Phanta MaxMaster Mix)、一步克隆试剂盒(ClonExpress II OneStep Cloning Kit)、无内毒素质粒大量提取试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DNA Mark-er、Loading Buf
16、fer、限制性内切酶 Sac I 和 HindIII 均购自 TaKaRa;氨苄青霉素(Amp)购自上海翊圣生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)购自Gibco 公司;PBS 缓冲液、胰蛋白酶消化液和DMEM High Glucose 均购自 BI 公司;双抗(Peni-cillin 10000 IUmL1-Streptomycin 10 mgmL1)购自MP 公司;化学发光试剂盒(BeyoECLPlus)、双萤光素酶报告基因检测试剂盒、转染试剂(Lipo8000)均购于碧云天生物技术有限公司;pGL3-Basic、pRL-TK 载体由本实验室保存。1.3 方法1.3.1生物信息学分析通过 NC
17、BI 的 GenBank 数据库获得大黄鱼及第 4 期周锐涛等:大黄鱼 slitrk3 基因启动子克隆及转录调控分析69其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列(表 1),采用 Meg-Ailgn 软件中的 Clustal W 进行多重序列比对,同时使用 MEGA 11 软件中的近邻相接法,设置 boot-strap 重复 1 000 次,构建大黄鱼及其他物种的Slitrk3 氨基酸序列系统进化树。利用在线分析软件 BDGP(http:/www.fruitfly.org/seq_tools/pro-moter.html)设置 Minimum promoter score 为 0.8,预测 sli
18、trk3 基因潜在转录起始位点,利用在线分析软件 Methprimer(http:/www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)设置 length100,Obs/Exp0.6,GC%50%,预测 slitrk3 基因潜在的 CpG 岛。利用在线分析软件 AliBaba2.1(http:/gene- pairsim to known sites 为 64,matrix con-servation 为 80%,预测 slitrk3 基因潜在转录因子结合位点。1.3.2引物设计根据生物信息学分析的结果,利用 Primerpremier 6.0
19、软件设计大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段扩增引物(表 2),引物合成均由北京擎科生物科技有限公司完成。1.3.3slitrk3 基因启动子不同长度片段的扩增以提取大黄鱼腹鳍组织的 DNA 为模板,根据设计的扩增引物进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为10 L:DNA 模板 1 L,2PCR Mix 预混液 5 L,上下游引物各 0.2 L,ddH2O 3.6 L。PCR 反应程序:94 预变性 5 min;94 变性 15 s,58 退火 10 s,72 延伸 2 min,35 个循环;72 再延伸10 min。取 PCR 扩增产物进行 1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测。表1
20、 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列的GeneBank 登录号Table 1 GeneBank ID of amino acid sequences ofSlitrk3 in L.crocea and other species物种SpeciesGeneBank登录号GeneBank ID大黄鱼 Larimichthys croceaXP_010750353.1棘头梅童鱼 Collichthys lucidusTKS81208.1金钱鱼 Scatophagus argusXP_046245335.1大西洋鲷 Sparus aurataXP_030298892.1黃鲈 Perca f
21、lavescensXP_028430026.1大鳍弹涂鱼 Periophthalmus magnuspinnatusXP_033832314.1斑马鱼 Danio rerioXP_021323398.1大鼠 Rattus norvegicusNP_001101153.1小鼠 Mus musculusNP_001344780.1智人 Homo sapiensNP_001305739.1表2 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的扩增引物Table 2 Primers used for fragments amplification primers of L.crocea slitrk3
22、 gene引物Primer序列(53)Sequence(53)扩增区域Amplification region/bp产物大小Amplification size/bpslitrk3-P1F:ctatcgataggtaccGAGCTCATCCGTAGCTCATTCACATGC1970+162029R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P2F:ctatcgataggtaccGAGCTCGCGGAATCAATCATTTCTGGA1614+161673R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTC
23、Gslitrk3-P3F:ctatcgataggtaccGAGCTCGAATCCTCGATCAGCCGATGT1210+161269R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P4F:ctatcgataggtaccGAGCTCCAAACTGACACCTATTTTTCC667+16726R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P5F:ctatcgataggtaccGAGCTCTGTCTGAGTGGAGAGATTTGT376+16435R:cagtaccggaatgccAAG
24、CTTAGGTAACCCACAGCATCCTCGslitrk3-P6F:ctatcgataggtaccGAGCTCCTTTGTGAGGGTGTGTGTATC147+16206R:cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG注:单下划线为 Sac I 酶切位点,下划线为 Hind III 酶切位点,小写字母为质粒同源序列。Note:The single underline are the Sac I restriction enzyme digestion sites;the underline is the Hind III restriction en
25、zyme digestion site;and thelowercase letters are the plasmid homologous sequences.70南 方 水 产 科 学第 19 卷1.3.4slitrk3 基因启动子不同长度片段双荧光素酶报告基因质粒构建按照胶回收试剂盒说明书要求对 PCR 扩增产物进行胶回收纯化;利用限制性内切酶 Sac I 和Hind III 对载体 pGL3-Basic 进行酶切线性化处理;酶切线性化反应体系为 40 L:Sac I 和 Hind III 各1 L,Buffer 4 L,载体 4 L,ddH2O 24 L。酶切线性化反应条件:37 酶
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