组学技术在赭曲霉毒素A研究中的应用进展.pdf
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1、文章编号(2023)08-1551-11Journalof NuclearAgricultural Sciences1551核农学报2 0 2 3,37(8):1551 156 1组学技术在赭曲霉毒素A研究中的应用进展闫静阎贺静王薇薇李军*朱凤妹(河北科技师范学院食品科技学院,河北秦皇岛066600)摘要:赭曲霉毒素A(O c h r a t o x i n A,O T A)是人类和动物饮食中最常见的真菌毒素之一,是一种由曲霉或青霉产生的次级代谢产物。OTA具有肝毒性、肾毒性、肠毒性、神经毒性、免疫毒性、致癌、致突变等毒害作用,严重危害人和动物的健康。近年来,不同组学研究发展迅速,基因组学、转
2、录组学和蛋白质组学为确定OTA生物合成的分子关键步骤提供了新的信息,代谢组学技术也广泛用于研究OTA的毒性及其机制。本文从基因组、转录组、蛋白质组以及代谢组等组学技术对OTA的研究进行了综述,并提出了相关研究的发展趋势以及有待解决的问题,利用多组学技术有助于全方面了解OTA,为研究OTA的生物合成、毒性机制及防控提供了理论参考。关键词:赭曲霉毒素A;基因组学;转录组学;蛋白质组学;代谢组学D0I:10.11869/j.issn.1000-8551.2023.08.1551赭曲霉毒素(Ochratoxin)是由多种曲霉属和青霉属产生的一类次级代谢产物,该物质含有多种结构类似化合物,如赭曲霉毒素A
3、(O c h r a t o x i n A,O T A)、赭曲霉毒素B(Ochratoxin B,OTB)、赭曲霉毒素C(Ochratoxin C,OTC)、赭曲霉毒素(O c h r a t o x i n,O T)、赭曲霉毒素(O c h r a t o x i n,OT)等。其中OTA的毒性最大,分布最广,含量最高,对农产品的污染最重,广泛存在于各种食品、中草药及香料中,严重危害人类健康 。且OTA有热稳定强、水溶性差的特点,在食品中经高温加工(2 50)难以去除,因此世界各国对各种制品中的OTA含量制定了严格的监管限制及检测技术手段1-4,具体信息如表1所示。在已发现的多种真菌毒素中
4、,OTA的危害程度仅次于黄曲霉毒素。研究表明,OTA具有多种毒害作用,如肾毒性、肝毒性、肠毒性、免疫毒性、致畸、致癌、致突变等,是巴尔干地方性肾病的诱因之一2 。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)和世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)已将OTA归类为2 B类致癌物2 3。组学技术是研究真菌毒素领域的重要工具,用于识别生物标记物,检测真菌毒素的种类并探究其生物合成途径。本文拟对近年来应用组学技术对OTA研究的情况做一概述,旨在为相关科技工作者对OTA的生物合成机制、致毒机理、污染防
5、控以及抗赭曲霉毒素药物的开发等方面提供参考。1基基因组学技术在赭曲霉毒素A研究中的应用基因组学是一门对生物体所有基因进行集体表征、定量研究及不同基因组比较研究的交叉生物学学科。基因组学技术能识别与真菌毒素产生有关的基因,并分析相关基因组的结构、功能、进化、定位、编辑和作用2 4。基因组学包括多种内容,如功能基因组学、结构基因组学、比较基因组学和宏基因组学等。其中功能基因组学有助于了解宿主与真菌的相互作用及影响真菌毒素产生的遗传因素,对于制定防控OTA污染的策略起重要作用2 5。比较基因组学是用于比较不同物种或不同群体间的基因组差异和相关性的系统生物学研究,目前广泛用于研究OTA的生物合成途径。
6、随着基因组学不断的发展,OTA的生物合成途径研究不断深人。Wang等2 6 利用Aspergillus ochraceus、Aspergillus carbonarius Aspergillus niger、A s p e r g i l l u s s t e y n i i,收稿日期:2 0 2 2-10-2 0 接受日期:2 0 2 2-12-2 7基金项目:国家自然科学基金资助项目(32 2 7 158 2),河北省重点研发计划项目(2 137 2 8 0 1D)作者简介:闫静,女,主要从事食品生物技术研究。E-mail:2 9 39 8 8 4430 q q.c o m*通讯作者:李
7、军,男,教授,主要从事食品生物技术研究。E-mail:s p g c x 16 3.c o m;朱凤妹,女,教授,主要从事食品生物技术研究。E-mail:z h u f e n g me i 0 7 14 16 3.c o m。同为通讯作者。155237卷核报农学表1各种制品的污染情况及相关标准限量Table1Contamination of various products andrelevant standard limits国家标准限量污染物含量National参考文献ContaminationContentstandard limitReferences/(gkg*)玉米Corn025
8、.90 gkg-l5.05小麦Wheat0.1634.75 gkg-l5.05大米Rice024.90 gkg*l5.06高粱1.0427.80 g kg-l5.07Sorghum grains大麦Barley0.16 185.24 g:kgl5.08燕麦Oat0.534.00 g:kgl5.09黑麦Rye0.2 1 10.00 g kg*5.010葡萄Grape0 10.14 g:kg*l11葡萄酒Wine0.308.60 ng L-12.012啤酒Beer4.00100.00 ng L-113烘焙咖啡4.80120.20 gkg*15.014Roasted coffee速溶咖啡4.0931
9、.40 gkgl10.015Instantcoffee茶Tea0.01 93.76 g:kg*110.015牛奶Milk2.00270.00 ng L-116肉制品0.06103.69gkg*117Pork products奶酪Cheese1.30 22.40 g kg*18坚果Nuts0.06 1.78 g:kgl10.019草药0.02 23.82 g kg120.019Medicinal herbs香料Spices0.12452.46 gkg*115.019油籽Oilseed0271.00 gkg*l5.019饲料Feed1.897.68 g kg*19婴儿食品0.6022.10 g k
10、g*0.520Baby formulae巧克力0.180.75 gkg*l21ChocolateAspergillus westerdijkiae和Penicillium nordicum均可以产生OTA,经基因组比较分析,鉴定出了与OTA生物合成相关的关键基因并推测出合成途径,即起始由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A经聚酮合成酶(polyketidesynthases,PKS,基因名OtaA)作用合成7-甲基蜂蜜曲霉素,然后被细胞色素P450单加氧酶(OtaC)氧化生成OT。O T 和L-苯丙氨酸在非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS,基因名 Ot
11、aB)作用下形成酰胺键进而形成OTB。O T B再经卤代酶(OtaD)氯化,最终得到OTA,如图1所示。此外,该项研究还证明了OT和OTB是OTA生物合成的中间产物,而OTC和OT则不是。这项研究成功证明了所有OTA产生菌中都存在一条统一的OTA生物合成途径,包含4个高度保守的基因和1个碱性亮氨酸拉链转录因子(basicleucinezipper,bZIP,基因名OtaRI),并阐明了途径中的特定基因、特定酶与代谢中间产物的关系。在此基础上,Ferrara等2 7 通过对产OTA的19 种曲霉和2 种青霉进行基因组比较,分析发现在PKS和NRPS之间存在一个新基因,该基因序列中的SnoaL环化
12、酶结构域(OtaY)起到了推动OTA合成的作用。这是首次在A.carbonarius已知的OTA生物合成基因簇上发现了一个新的未知基因,基因簇如图2 所示。这为更深入全面地了解OTA生物合成提供了新证据。与传统的真菌毒素检测方法相比,聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)可以更加便捷、快速、高效、准确地检测出OTA。Su s c a 等2 8 从奶酪表面分离了5株A.westerdijkiae并分析其基因组序列数据,发现编码bZIP转录因子的基因只存在于产OTA菌株中。利用这一信息设计了一种PCR方法,可以专一地识别并区分A.westerdijkiae能否产生
13、OTA。张健等2 9 利用A.nigerCBS513.88中PKS的酰基转移酶结构域(a c y l t r a n s f e r a s e,A T)设计引物,建立了一个针对产毒黑曲霉的PCR检测方法,该方法适用于产毒黑曲霉的初筛,对黑曲霉产毒污染农产品具有良好的检测及预警作用。基因组学的进步引发了系统生物学领域的一场革命,促进了对复杂生物系统的理解。将新发现的每一种产毒菌株的基因组序列进行比较分析,经过不断修订,改进基因组注释并对预测基因进行比较,可以提高对OTA合成途径的了解。从基因组数据中挖掘的与OTA相关的基因及不同菌种之间的差异基因都将是研究OTA调控、防治的重要对象。基因组学还
14、有望促进治疗OTA药物的开发,并为制定预防人和动物疾病的策略提供重要信息。尽管该技术已经揭示了OTA生物合成的一些关键酶促反应,但其生物合成途径及其调控机制尚未完全阐明,需要和其他组学技术相结合才能更好地说明问题2车转录组学技术在赭曲霉毒素A研究中的应用转录组学是在整体水平上研究细胞中基因转录及转录调控规律的一门学科,是研究细胞表型和功能的重要手段30 。转录组学已经广泛应用于研究真菌毒素,可以同时检测大量基因表达的变化,提供有关基因组结构和有毒化合物诱导细胞机制的信息31。因此,1553组学技术在赭曲霉毒素A研究中的应用进展8期CoAOHOHOP450/黄素嘌呤二核苷酸乙酰辅酶A(1)依赖性
15、氧化还原酶HOOCCOOHacetyl CoA(1)PKSP450/FAD-dependent oxidoreductaseOtaANH2CH,OtaC/OtaECH,CoA7-甲基蜜蜂曲霉素L-苯丙氨酸HO7-methylmelleinOTL-phenylalanme丙二酰辅酶A(4)NRPSOtaBmalonyl CoA(4)COOHOHOCOOHOHOHALNHOtaDNHCH;CH,C1OTAOTB图1推测的OTA生物合成途径Fig.1The putative OTA biosynthesis pathwayOtaR2OtaAOtaYOtaBOtacOtaR1OtaD注:otaR2为锌
16、指DNA结合蛋白。Note:otaR2 is a zinc finger DNA binding protein.图2预测Aspergilluscarbonarius的OTA生物合成基因簇Fig.2Prediction of OTA biosynthesis gene cluster in Aspergillus carbonarius应用转录组学可以确定OTA的生物合成途径、阐明其药理学及毒理学机制,为预测遗传毒性和致癌性提供有用的信息。A.carbonarius是OTA的主要产生菌,是农产品中广泛存在的真菌病原体,严重威胁人和动物的健康,但不是所有的A.carbonarius都能产生OTA
17、,研究菌株之间的差异能制定有效的防控策略,降低食品中OTA的污染3-3。高通量测序技术(transcriptome sequencing,RNA-Seq)、逆转录 PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR和高通量微阵列分析等转录组分析手段已广泛用于真菌毒素的研究中。利用RNA-Seq分析两种A.carbonarius(产毒与不产毒)与OTA相关的转录变化,在不产毒的菌株中存在大量的差异表达基因,并利用实时荧光定量PCR(q u a n t i t a t i v e r e a l-t i me PCR,q RT-PCR)进行验证。其中所有与OTA生物合成相关的
18、假定基因均下调幅度最大,AcOTAbZIP的下调可能是不产OTA的主要原因。此外,AcOTApks基因中的AT结构域中存在有害突变,也阻止了OTA的产生33。基因可以在不同的环境条件下进行不同的调节和表达,进而合成不同的代谢物34,如表2 中的环境因素部分所示。干腌火腿是一种重要的肉类产品,通常霉菌有助于火腿感官品质的发展,然而一些霉菌如P.nordicum能在高盐环境中产生OTA。q RT-PCR分析表明,NaC1可通过激活参与OTA生物合成途径中的otapksPN和otanpsPN基因,从而导致OTA的产生2 4此外,产毒能力强的P.nordicum不需要毒素和NaCl的诱导就可产生大量的
19、OTA,而产毒能力弱的菌株则需要诱导34。这为减少干腌肉制品中的OTA污染奠定了基础。目前,OTA的多种毒性机制尚未阐明,可以利用转录组学技术开展相关的毒理学研究35-39 ,如表2 中毒理学机制部分所示。OTA是一种有效的肾致癌物,且作用效果具有性别差异,以小鼠为研究对象,雄鼠对OTA更为敏感,雄鼠体内大量的差异表达基因主要与代谢(Cyp2cll、Cy p 2 d l、Cy p 2 d 5、D h r s 7)、钙稳态(Gc、S100g)和转运(Slc51b)有关35。斑马鱼中发生肝癌的相关基因和途径与人类之间高度保守36 ,以斑马鱼胚胎为研究对象,研究转录组首次发现OTA对早期发育脊椎动物
20、具有肝毒性并阐明了其作用机制37 。该研究可为评估孕妇和发育中个体的健康风险提供更多信息。向分化的人肠上皮细胞系Caco-2细胞加人不同浓度的OTA共培养后进行转录组分析,确定了OTA引155437卷报核农学起肠功能损害的部分原因38 。这项研究强调了OTA的肠道毒性,并提供了生物反应的全基因组视图,为肠道毒性提供了理论基础,并有助于确定OTA的最大残留限量,但还需进行更详尽的研究阐明所有的潜在机制。转录组学有助于理解复杂的生物系统和开发新的生物标记物,这些可以帮助早期诊断疾病,并找到有效的治疗方法或药物,如表2 生物防治部分所示。转录组学已证明Bacillussubtilis可通过产生伊枯草
21、菌素A抑制A.carbonarius的生长和OTA的产生39 。这一发现为开发高效的抗OTA药物提供了有效信息,对农业和生物医学具有重要意义。OTA生物降解的主要机制为酰胺键水解后降解为无毒或低毒的OT。从微生物和动物胰腺中分离或克隆的一些OTA降解酶,在食品和饲料工业中有着巨大的应用前景,但微生物在食品和饲料工业中的应用必须谨慎,尤其要注意安全性。表2 转录组学在影响OTA合成的环境因素、OTA毒理学机制与生物防治方面的应用Table 2 Application of transcriptomics in environmental factors affecting OTA synthes
22、is,OTA toxicologicalmechanisms and biological control研究方向研究内容试验结果参考文献ResearchdirectionResearchcontentsExperimental resultReferences环境因素高NaCl高产毒菌株的OTA合成基因不受外源OTA和NaCI浓度的影响,与之相反,产毒能力35Environmental factors弱的菌株受到影响毒理学机制致肾癌试验受体:小鼠36Toxicologicalmechanisms其作用具有性别差异,男性更为敏感,其机制可能与代谢、转运、核受体和细胞增殖或调亡等基因相关致肝癌试
23、验受体:斑马鱼胚胎37OTA能抑制肝母细胞分化过程中两个关键转录因子造血表达同源框(Hhex)和prospero同源框1(prox1)的表达,并抑制肝细胞增殖,导致肝脏变小,凝血因子和肝脏特异性microRNA-122的信号水平降低,最终使肝脏的发育中断肠毒性试验受体:小鼠38OTA激活了肿瘤蛋白p53介导的细胞凋亡信号通路,导致小鼠双微体2 基因(MDM2)下调,半胱天冬酶3(CASP3)上调,使OTA诱导分化的Caco-2细胞调亡生物防治伊枯草菌素A抑制OTA产生:Bacillus subtilis可通过产生伊枯草菌素A对多种代谢途径造成显著干39Biological control扰,从
24、而抑制Aspergilluscarbonarius的生长和OTA的产生由于转录调控在真菌次级代谢过程中的重要性,转录组分析可以作为深人了解OTA的重要工具。经过回顾OTA的相关转录组研究,虽然该技术没有阐明OTA的作用模式,但有助于研究OTA的毒理学信息。因此,转录分析方面仍需进行大量的工作,以便在转录组水平上提取到更多关于OTA的信息,为研究和理解OTA的生物学开辟新的途径。同时,转录组与经典毒理学或与其他组学技术相结合的研究将成为热潮,能更深人地探究影响OTA作用模式的因素3蛋白质组学技术在赭曲霉毒素A研究中的应用蛋白质是生理生化途径的重要组成部分,是体内代谢的主要信号分子,蛋白质组学可以
25、重点识别和表征参与OTA代谢途径中的蛋白质,包括研究每种蛋白质的细胞位置、亚型和功能,以阐明生物系统中发生的分子过程,对于揭示生物过程中潜在的分子机制至关重要40 。微生物种类、营养条件和环境信号等因素影响着OTA的生物合成41。(Crespo-Sempere等42 首次利用蛋白质组学分析两种A.carbonarius(产毒与不产毒)中与OTA产生相关的蛋白质,二维凝胶电泳和质谱法表示这些蛋白质可能在氨基酸代谢、氧化应激和孢子形成通路中发挥作用;同时,还发现了一种上调的功能未知的蛋白质CipC,通过RT-PCR证实了该蛋白参与OTA的生物合成,为OTA生物合成途径提供了新见解。环境因素对OTA
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- 技术 曲霉 毒素 研究 中的 应用 进展
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