串联荧光标记LGG-1检测秀丽线虫表皮自噬流.pdf
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1、生命科学版),2023,44(4):59-6 7.引文格式:朱怡,严晨啸,杨玉妍,等.串联荧光标记LGG-1检测秀丽线虫表皮自噬流.扬州大学学报(农业与Jul.2023Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2023年7 月Vol.44 No.4扬州大学学报(农业生命科学版)第44卷第4期DOI:10.16872/ki.1671-4652.2023.04.008串联荧光标记LGG-1检测秀丽线虫表皮自噬流朱怡,严晨啸1-2,杨玉妍1.,傅容1*(1.苏州大学生物医学研究院,江苏苏州2 1512 3
2、;2.南京医科大学基础医学院,南京2 1116 6;3.苏州贝康医疗器械有限公司,江苏苏州2 1512 3)摘要:为建立特异性检测线虫表皮细胞自噬流的工具,以利研究自噬在发育、免疫和结构损伤等方面的作用,利用表皮特异性启动子DPY-7P构建表皮特异性表达串联荧光标记的LGG-1/LC3的转基因虫株(DPY-7P::G FP::mCh e r r y:LGG-1);然后根据GFP和mCherryPH稳定性的差异设计通过测量红绿信号比值判断自噬小体和自噬溶酶体的方法;并通过RNAi敲降自噬调节因子LET-363/mTOR和RAB-7/RAB7A,验证了该报告系统的定量方法可有效反映自噬流的激活和阻
3、断。进一步利用该报告系统证实表皮机械损伤可在远离伤口的区域诱发自噬,并发现机械损伤可能激活伤口附近的溶酶体。综上,该报告系统可为深入探究表皮自噬的机制与生理意义提供有效的研究工具。关键词:秀丽隐杆线虫;表皮细胞;自噬流;串联荧光标记LGG-1/LC3中图分类号:R392文献标志码:A文章编号:16 7 1-46 52(2 0 2 3)0 4-0 0 59-0 9Monitoring the autophagic flux of the Caenorhabditis elegansepidermis by tandem fluorescent-tagged LGG-1ZHU Yi,YAN Che
4、nxiaol2,YANG Yuyanl.3,FU Rong(1.Institute of Biology and Medical Sciences,Soochow University,Suzhou 215123,China;2.School of Basic Medical Sciences,Nanjing Medical University,Nanjing 211166,China;3.Suzhou Basecare Medical Device Company Limited,Suzhou 215123,China)ABSTRACT:In order to establish a sp
5、ecific tool to detect the autophagic flux of the Caenorhabditis elegans epidermis indevelopment,immunity,structural damage and other biological processes,we constructed a transgenic strain DPY-7P:GFP:mCherry:LGG-1 in which tandem fluorescent-tagged LGG-1 was specifically expressed in the epidermis.B
6、ased ondifferent pH stability of mCherry and GFP fluorescent proteins,the ratio of mCherry to GFP fluorescence was used todistinguish autophagosomes from autolysosomes.We verified that this report system and quantification method can reflectthe induction and block of autophagic flux through RNAi aga
7、inst the autophagy regulators LET-363/mTOR and RAB-7/RAB7A.Furthermore,we confirmed that mechanical injury induced autophagy in the subcellular regions distant from theinjury site and found that mechanical injury could activate lysosomes around the wound using the DPY-7P:GFP:mCher-ry:LGG-1 reporter.
8、The DPY-7P:GFP:mCherry:LGG-1 reporter provides an effective tool for exploring the mecha-nism and physiological significance of autophagy in the epidermis.KEY WORDS:Caenorhabditis elegans;epidermal cells;autophagic flux;tandem fluorescent-tagged LGG-1/LC3自噬是一种进化上保守的分解代谢机制,通过该机制,真核细胞运用膜运输途径降解循环胞内成分。自
9、噬可降解错误折叠的蛋白质、清除受损的细胞器,并为细胞提供可持续的生物分子和能量,从而在饥饿、氧化、热激等应激条件下维持细胞稳态。因此,自噬与许多生理病理过程均密切相关,例如胚胎收稿日期:2 0 2 2-0 6-0 8基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(BK20200866);江苏省高校优势学科建设工程项目(PAPD)作者简介:朱怡(198 5一),女,江苏常熟人,苏州大学实验师,主要从事上皮细胞结构和功能研究。*通信作者,傅容,苏州大学副教授、博士,主要从事上皮细胞结构和功能研究;E-mail:f r l 31 s u d a.e d u.c n。60第44卷扬州大学学(生命科学版)的发育、
10、衰老、饥饿、感染免疫等。自噬主要有3种类型,即微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬(CM A)。本研究关注的是巨自噬(以下简称自噬)的检测。自噬涉及一系列动态的膜形成和融合过程,自噬被诱导后,首先会形成1个月牙形的双膜囊,称为吞噬泡(phagophore);这个囊进一步膨胀并最终闭合,产生1个包裹着自噬底物的双膜隔室,称为自噬小体(autophagosome);自噬小体进一步与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome),最终完成成熟过程并降解自噬底物。从自噬小体被诱导生成到自噬小体被溶酶体融合消化的整个动态过程又称为自噬流(autophagic flux)。在哺乳动物活体内实时观察特定
11、组织中的自噬过程具有相当大的难度,秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)则为解决这一问题提供了良好的生物模型。秀丽隐杆线虫不仅有高度保守的自噬基因,而且通体透明,因此极大方便对其活体各个组织的自噬情况进行显微观察。与哺乳动物相比,秀丽隐杆线虫表皮结构简单,主要由一层多核上皮细胞构成,是研究表皮细胞生理病理机制的理想模型。近年来研究显示自噬在线虫表皮的发育,免疫防御和结构损伤中发挥重要作用2-4。而深人解析表皮细胞自噬的调节机制则需要实时检测表皮细胞在不同发育阶段及环境刺激下的自噬流变化情况,但目前尚缺乏准确且特异性地检测表皮细胞自噬流的方法。哺乳动物LC3的同源蛋白LGG-
12、1是在线虫中最常用于检测自噬的标记蛋白。LGG-1及其同源蛋白LC3一样通过C末端的脂化而被募集到自噬小体膜上。2 0 0 3年,Melendez及其同事构建了第1个由其本身的启动子驱动表达GFP:LG G-1的虫株5,该虫株迅速成为在秀丽隐杆线虫中标记自噬小体最常用的方法(虫株DA21236)。但由于GFP在酸性坏境下易被淬灭,因此GFP:LG G-1只能显示自噬小体而不能显示自噬溶酶体。而自噬的诱导增强,自噬溶酶体的形成障碍或溶酶体降解功能异常均可导致GFP:LGG-1聚集增加,因此需要采用其他方法进一步分辨以上不同的自噬调节状态。鉴于GFP和mCherry对溶酶体的酸性pH值具有不同的敏
13、感性,因而串联融合蛋白GFP::mCh e r r y::LG G-1被构建,这使得自噬溶酶体(仅mCherry阳性)和自噬小体(GFP和mCherry双阳性)不仅都能被显示出,还可被区别开来,从而实现对自噬流更全面的监测,但目前该融合蛋白分别构建在PIE-1启动子和LGG-1自身启动子的下游7-8 。PIE-1启动子只表达于早期胚胎和生殖细胞 ,而LGG-1自身启动子表达组织众多,因此用于监测表皮细胞自噬情况时容易受到相邻组织自噬信号的干扰。本课题组采用表皮特异性启动子DPY-7P构建DPY-7P:G FP:mCh e r r y:LG G-1转基因虫株。接着通过RNAi敲降自噬负向调控因子
14、mTOR的同源蛋白LET-363和自噬溶酶体形成的必需成分RAB-7,然后利用激光共聚焦显微镜观察并统计DPY-7P:G FP:m Ch e r r y:LG G-1所标记的自噬小体和自噬溶酶体数量,从而验证该报告系统可有效检测自噬流的诱导和抑制。此外,研究也利用该报告系统进一步证实机械损伤在单个表皮细胞内产生对自噬的远端促进效应。因此本研究开发的DPY-7P:G FP::mCh e r r y::LG G-1转基因虫株可用于进一步探究表皮细胞在各种生理病理过程中的自噬,为解析表皮自噬机制和生理意义提供有效的工具。1材料与方法1.1虫株和菌株1)试验动物:野生型秀丽隐杆线虫2)细菌品系:大肠埃
15、希菌菌株OP50-尿嘧啶缺陷型线虫饲养菌种、感受态细胞DH53)RNA i 文库:C.elegans ChrRNAi library(英国SourceBioscience公司)。1.2主要试剂硼酸、Tris碱、胆固醇、Tween-20、IPT G、ED T A、琼脂、琼脂糖等(上海生工生物工程公司),Pep-tone(北京索莱宝科技公司),NGM琼脂(德国Calbiochem公司),各种限制性内切酶(美国NEB公司),ClonExpressMultiS(南京诺唯赞生物科技公司),PrimeSTARGXLPremix(日本TaKaRa公司),胶回收试剂盒(德国Qiagen公司),质粒提取试剂盒(
16、美国Axygen公司),QIAquickspinmini-prepkit(德国Qiagen公司),线虫NGM培养基、M9缓冲液、bleach溶液(自配)。1.3线虫培养将OP50单菌落接种至50 mL的LB液体培养基中,37 振荡培养过夜。吸取2 0 0 L经检验无61朱怡等:串联荧光标记LGG-1检测秀丽线虫表皮自噬流第4期污染的大肠埃希菌OP50菌液于6 cmNGM固体培养基上,过夜晾干后在37 培养箱中倒置培养。挑取健康的野生型秀丽隐杆线虫放置其中,线虫在2 0 培养箱中培养,注意观察线虫的生长状态并及时分盘培养。1.4重组质粒DPY-7P:G FP:m C h e r r y:LG G
17、-1的构建1.4.1利用PCR技术获得目的基因LGG-1和mCherry的片段1)引物序列:LGG-1-F为5-GCATGGACGAGCTGTACAAGATGAAGTGGGCTTACAAGGAG-3,LGG-1-R 为 5-ACCGGCGCTCAGTTGGAATTTTTGTGTCTTCTTCGTTTATTCATG-3;mCh e r-ry-F为 5-ACAAACAGCATTCGTATAATCTCGAGATGGTGAGCAAGGG-3,mCh e r r y-R 为 5-CTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3。2)PC R扩增及切胶回收:使用PimeSTARGXLPremix,根据说明书
18、配置反应体系,进行PCR反应,使用胶回收试剂盒进行切胶回收。1.4.2重组质粒的构建1)连接:使用ClonExpressMultiS试剂盒进行连接反应。2)转化:使用感受态细胞DH5进行转化试验,最后将菌液均匀涂布于含氨苄的LB固体培养基上,然后在37 条件下培养过夜。1.4.3重组质粒的筛选鉴定1)PC R扩增:挑取单菌落使用PrimeSTARGXLPremix进行PCR反应,阳性对照是从野生型线虫中提取的DNA模板,阴性对照是从阴性克隆菌落提取的DNA模板。2)酶切鉴定:使用质粒提取试剂盒提取重组质粒进行酶切验证,使用限制性内切酶StuI和SpeI,得到3个酶切片段,长度分别为4518、1
19、8 45和2 2 2 bp。3)样品送苏州金唯智生物科技公司进行测序,1.5DPY-7P::G FP::m C h e r r y:LG G-1转基因虫株的构建1.5.1试验前准备1)挑选生长状态良好、处于年轻成虫阶段的野生型秀丽隐杆线虫备用。2)制备显微注射针及载有琼脂糖的盖玻片,并在烘箱中烘干备用。3)使用QIAquickspinminiprepkit提取质粒备用。4)配制注射液,成分为10 ngL-1质粒DPY-7P:G FP:mCh e r r y:LG G-1,2 0 n g L-1标记基因表达载体MYO-2P:G FP(咽部表达绿色荧光蛋白),450 ngL-1载体质粒pPD49.
20、78。1.5.2显微注射将配制的注射液注人线虫生殖腺,一次注射约30 条线虫,将注射好的线虫置于2 0 培养箱内培养恢复。1.5.3筛选待显微注射过的线虫恢复正常状态后,在NGM固体培养基上单独培养PO代线虫直到F1代线虫大量出现,在荧光体式显微镜下观察并挑取咽部表达GFP的F1代线虫于新的NGM固体培养基上,从而筛选出传代率较高的虫株。1.6RNAi1.6.1RNAi培养基的制备根据所需敲降基因的基因序列号,查找其对应的RNAi克隆在RNAi文库里的位置,划板摇菌后提取质粒测序验证,将验证正确的RNAi单菌落进行RNAi培养基制备。1.6.2线虫同步化1)将DPY-7P::G FP:m Ch
21、 e r r y::LG G-1转基因虫株用线虫NGM培养基培养至有较多的成虫。2)用1mLM9缓冲液收集线虫于洁净的1.5mLEP管中,待线虫沉降至管底后弃上清,重复此步骤直至溶液澄清(约2 4次)。3)加人1mL现配的bleach溶液,室温静置6 0 s。培养至成年。将62第44卷扬州大学学报(农业与生命科学版)4)以38 0 0 rmin-1转速离心6 0 s。5)弃去上清,加人1mLM9缓冲液,以38 0 0 rmin-1转速离心6 0 s。6)弃去上清,留存溶液约50 L,将管底的混合物转移到普通的线虫NGM培养基上7)2 0 培养12 h,待卵孵化后备用。1.6.3RNAi处理株转
22、移到上述制备完成的RNAi固体培养基上,2 0同步化后孵化的L1转基因虫株转移到上述制备完成1.6.4制片观察快速地挑取足量的线虫放在制备好的琼脂糖载玻片上,琼脂糖上已提前滴加适量盐酸左旋咪唑溶液,小心盖上盖玻片,并用胶布将盖玻片固定在载玻片上。沿盖玻片边缘加人适量M9缓冲溶液,从而避免线虫干凋死亡。使用激光共聚焦显微镜采集图像。1.7表皮机械损伤挑取成虫至预冷的NGM培养皿上,手持显微注射针对其进行针刺损伤,在线虫身体前端制造1个伤口。损伤后的线虫转移至新培养皿上恢复1.5或3h后进行GFP:m Ch e r r y:LG G-1荧光信号采集。1.8自噬点测量统计1)测量:选取同一视野下红绿
23、荧光双通道、红色荧光单通道和绿色荧光单通道3张图像。在线虫表皮细胞处选定面积为6 31.2 m的矩形测量框(保存备用,所有样本测量均使用同一测量框),对测量框内聚集的荧光点用圆形工具圈定,分别测量该荧光聚集点的红色荧光和绿色荧光的强度并保存。以上操作均使用ImageJ图像处理系统。2)数据统计:红光荧光强度与绿光荧光强度比值0.47 记为自噬溶酶体(autolysosome);红光荧光强度与绿光荧光强度比值 0.47 被计为自噬溶酶体,比值 0.47 则计为自噬小体。使用激光共聚焦显微镜采集图像并统计分析,结果表明LET-363RNAi显著增加自噬小体和自噬溶酶体的数量(图2),与LET-36
24、3RNAi增强自噬流的报道相符合,说明DPY-7P:G FP:mCh e r r y:LG G-1报告系统可有效地反映自噬流的增强。63朱怡等:串联荧光标记LGG-1检测秀丽线虫表皮自噬流第4期ADPY-7BCbpbpGFP12005000700DPY-7P:GFP:mCherry:LGG-120006585bpStulmcherryStulSpeLGG-1D绿色荧光green红色荧光red合并merge:o:dAda图1构建DPY-7P::G FP:mCh e r r y::LG G-1转基因虫株*Fig.1 Construction of the DPY-7P:GFP:mCherry:LG
25、G-1 transgenic strain*A.DPY-7P:G FP:m Ch e r r y:LG G-1质粒图谱;B.菌落PCR扩增mCherry片段;C.SpeI、St u l 双酶切质粒后的电泳图;D.DPY-7P:G FP:mCh e r r y:LG G-1在成虫表皮细胞中的表达情况,右上角显示实线框区域的放大图,比例尺代表2 0 m。A.T h e D PY-7 P:G FP:m Ch e r r y:LG G-1 p l a s m i d;B.m Ch e r r y f r a g m e n t s a m p l i f i e d b y c o l o-ny PC
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