整合宏基因组学分析生猪养殖...酵过程中微生物群落动态变化_赵素君.pdf
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1、动物医学进展,():整合宏基因组学分析生猪养殖粪污堆肥发酵过程中微生物群落动态变化收稿日期:基金项目:中央引导地方科技发展专项自由探索类基础研究项目();国家现代农业产业技术体系四川生猪创新团队项目();四川省科技计划(重点研发项目)();省财政运行专项项目()作者简介:赵素君(),女(满族),辽宁锦州人,副研究员,博士,主要从事分子遗传学研究。通讯作者赵素君,曹冶,李江凌,张金灵,刘锐,王秋实,于吉锋(四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,四川成都 )摘要:以猪粪和菌渣为发酵原料,进行有氧堆肥处理,在堆肥第、天,进行上、中、下分层多点采样,提取总 构建文库,经定量和检测合格后,利
2、用宏基因组测序分析堆肥过程中微生物区系变化与致病微生物动态变化。结果表明,堆肥期间微生物丰度发生明显变化,其中细菌丰度先升后降,病毒丰度变化平稳,真菌丰度稍有增长,古细菌丰度则稍有下降。在堆肥初始时,变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等微生物群落为优势菌门;变形菌门在堆肥的第天迅速达到高点,然后迅速下降并维持在原始水平,其中试验组的变化比对照组更为平稳;厚壁菌门在堆肥的前,丰度急速下降,然后缓慢下降;拟杆菌门在堆肥期间,丰度持续上升。同时,大肠埃希氏菌、沙眼衣原体、肠道沙门氏菌、化脓性链球菌、停乳链球菌等强致病微生物,随着堆肥的进行,其丰度均逐渐下降。试验组和对照组的菌群结构和丰度变化趋势均无显著差
3、异。关键词:宏基因组学;微生物群落;粪污;堆肥发酵中图分类号:文献标识码:文章编号:()随着我国畜牧业集约化和规模化的快速发展,养殖废弃物产生量不断增加。养殖废弃物排放已成为我国影响最大的污染物排放源之一,带来了巨大的环境压力。据 年农业部统计,我国每年产生的畜禽养殖废弃物已达到 亿吨,而综合利用率不足。养殖业污染形式十分严峻,包括粪尿、污水中的有机污染物随地表径流或贮粪池渗漏,污染地表水和地下水,生猪粪肥造成耕地超负荷富营养化,生猪粪污堆积产生的恶臭和温室气体会造成大气污染,病死猪、粪尿中还有各种病原微生物和寄生虫卵,导致生物污染。大量养殖废弃物没有得到有效处理和利用,成为养殖环境治理的一大
4、难题,从而受到全社会高度关注。现代堆肥技术通过添加特异性微生物,如纤维素降解菌剂和除臭菌剂等,提高微生物活性和数量,降低臭气产生,降解复杂有机物,改善堆肥效果。这些研究指出细菌数量呈现先增多后减少再增多的趋势,高温阶段的细菌种类最少;真菌数在整个堆肥过程中一直处于下降趋势;而放线菌的变化趋势与细菌相似,但比细菌总数低两个数量级。不同的堆肥时期,微生物种类和数量也不尽相同。升温期以嗜温微生物为主,高温期以嗜热微生物为主;降温期嗜温微生物重新得以生长繁殖,成为优势菌群。不同堆肥原料堆肥过程中优势菌群也有差异。污泥为原料,中、高温期微生物以细菌、霉菌为主;牛粪为原料,微生物以细菌、放线菌为主,其中氨
5、化细菌变化显著;鸡粪为原料,微生物以厚壁菌门和变形菌门为主;餐厨垃圾为原料,微生物以真菌、放线菌为主。同样,不同堆肥方式也存在差别,静态堆肥更易于温度的升高,灭杀病源微生物,堆肥周期短。其中槽式堆肥中梭菌属()均为优势菌种,而条垛式堆肥不同时期具有不同优势菌种,两种堆肥差异较大。这些研究大多采用生物化 学方 法、变 性 梯 度 凝胶电泳或 基于 基因序列的分析技术、温度梯度凝胶电泳等方法来进行,由于方法的限制 ,导致部分结果不完整。同时,各地的气候条件不同导致微生物种群结构千差万别。四川是养猪大省,在四川以猪粪为原料的研究还不明确。本研究通过整合宏基因组学技术,分析研究四DOI:10.1643
6、7/ki.1007-5038.2023.06.020川省规模化猪场粪污在高温堆肥过程中微生物区系和种群结构的动态变化,以及致病微生物的种群变化。为提高四川省乃至全国生猪养殖废弃物的无害化、资源化利用效率提供理论基础,并可望为解决四川省乃至全国生猪养殖粪污污染现状提供重要参考,对生猪的安全生产和畜牧业的可持续发展具有重大意义。材料与方法材料菌种有效微生物(,)菌,中国农业科学院肥料应用工程技术研究中心提供,包括芽孢杆菌、纳豆菌、放线菌、酵母菌和木霉菌等多种有益微生物及各种分泌性胞外酶类,有效活菌数 个。主要试剂和仪器粪便 提取试剂盒(),公司产品;样品均质研磨仪(),公司产品;测序仪(),公司产
7、品;,公司产品;生物分析仪(),公司产品;全自动紫外凝胶成像系统(),公司产品。方法堆肥在四川省畜牧科学研究院养猪研究所养猪基地进行堆肥,将同一猪圈的新鲜猪粪进行粪尿干湿分离,分离后的干猪粪混合均匀,再随机分成添加菌的试验组和不添加菌的对照组,两组分别堆成圆锥形粪堆,粪堆高,底部直径,并保持无其他污物混入。试验组按照粪便 菌发酵的比例添加 菌,添加时先根据粪便的干湿度,用水稀释 菌原液(稀释比例 ),洒施并均匀混合,最终粪便湿度控制在 。样品采集在堆肥第、天采样。每次分别在堆肥上层(离顶部)、中层(离顶部 )和底层(离底部)处按照多点采集原则采集样品,然后将样品全部混合,每次采集样本的总混合量
8、为 ,采集后的样品立即置于冰盒中运往实验室,置 保存,提取 用于宏基因组高通量测序分析。样品总 提取按 提取试剂盒说明书操作步骤提取和纯化样品总。文库构建和上机测序取样品 ,使用 (,)进行文库的构建,用 超声波破碎仪随机打断成长度约为 的片段,将 片段的末端进行修复、添加 尾、在片段两端添加测序接头、纯化这些 片段、扩增这些片段等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后,须进行文库质量检测。先使用 对文库进行初步定量,稀释文库至,随后使用 对文库的 进行检测,符合预期后,使用 方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度 ),以保证文库质量。库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的
9、需求 后用 测序。数 据 处 理使 用 (,:)对 测序平台获得的原始数据()进行预处理,获取用于后续分析的有效数据()。使用 软件()对 进行组装分析,然后将组装得到的 从 连接处打断,得到不含 的 。使用 (,:)对各样品的 ()进行 预测,并过滤掉预测结果中长度小于 的信息,对 预测结果,采 用 软 件(,:)进行去冗余,以获得非冗余的初始 。使用 ()将各样品的 比对至初始 ,计算得到基因在各样品中比对上的 数目,过滤掉各个样品中 数目的基因,获得 最 终 用 于 后 续 分 析 的 ()。从比对上的 数目及基因长度出发,计算得到各基因在各样品中的丰度信息,基于 中各基因在各样品中的丰
10、度信息,进行基本信息统计等分析。使用 软件(,:),将 与从 的 数据库(,:)中抽提出的细菌()、真菌()、古菌()和病毒()序列进行比对。对于每一条序列的比对结果,选取 最小 的结果,由于每一条序列可能有多个比对结果,采取 算法来确定该序列的物种注释信息。从 注释结果及基因丰度表出发,获得各个样品在各个分类层级(界门纲目科属种)上的丰度信息及基因零目表。结果测序数据质控及基因组装结果样品经初检合格后,进行文库构建以及文库检测,检测合格的文库将采用 进行测赵素君等:整合宏基因组学分析生猪养殖粪污堆肥发酵过程中微生物群落动态变化序,测序得到的下机数据()将用于后期信息分析。测序得到的原始数据(
11、)会存在一定比例的低质量数据,为了保证后续信息分析结果的准确可靠,首先要对原始数据进行质控及宿主过滤,得到有效数据()。检测的 (中测序错误率小于(质量值大于)的碱基数目的百分比)达 以上,(中测序错误率小于 (质量值大于)的碱基数目的百分比)达 以上,有效率(有效数据()与原始数据()的百分比)达 以上,说明数据真实可靠(表)。将 使用 组装软件进行组装分析(),组装得到的 从 连接处打断,得到不含 的序列片段,称为 ,采用 软件比对至各样品组装后的 上,过滤掉 以下的片段,并进行统计分析。结果发现样品中 数量达 以上,平均长度达 以上,(将 按照长度进行排序,然后由长到短加和,当加和值达到
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