鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用_程龙飞.pdf
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1、动物医学进展,():鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用收稿日期:基金项目:国家水禽产业技术体系项目();福建省科技厅农业科技重大专项项目();公益类科研院所专项项目()作者简介:程龙飞(),男,福建莆田人,研究员,硕士,主要从事家禽传染病防治研究。通讯作者程龙飞,陈红梅,傅光华,江南松,傅秋玲,万春和,黄瑜,刘荣昌,施少华(福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省禽病防治重点实验室福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 )摘要:为建立快速检测鸭血清多杀性巴氏杆菌抗体的方法,将兔抗鸭 标记胶体金,喷涂金标垫,用浓度为 的荚膜和 羊抗兔 抗体分别作为检测线和质控线,制备了检测鸭多杀
2、性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条()。特异性试验显示,仅鸭抗多杀性巴氏杆菌血清检测为阳性,阴性血清、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清的检测结果均为阴性,表明 的特异性良好。敏感性试验结果显示,对效价(琼脂扩散试验)的鸭抗多杀性巴氏杆菌血清 倍稀释后采用制备的试纸条检测结果仍为阳性,表明 的敏感性较高。重复性试验结果显示,同批次的不同试纸条和不同批次的试纸条,检测阴性血清和鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的结果相同,表明 的重复性好。对 份鸭血清采用 和 进行检测,结果显示,阳性符合率为 ,阴性符合率为 ,总符合率为 。结果表明,制备的 操作简单,具有较强的特异性、较高
3、的敏感性和较好的重复性,适合在兽医临床推广应用。关键词:鸭;多杀性巴氏杆菌;胶体金试纸条;荚膜中图分类号:;文献标识码:文章编号:()禽霍乱又名禽出血性败血症,是由多杀性巴氏杆菌()引起的主要侵害家禽和野禽的一种慢性或急性接触性、败血性传染病。外表健康的鸡和野生水禽都可能携带多杀性巴氏杆菌,在该病的流行中起重要作用。良好的饲养管理和合理的免疫接种是预防该病的有效方法。抗体水平是评价免疫效果的重要指标,也是制定合理的免疫程序的重要依据。已建立的检测多杀性巴氏杆菌抗体的方法有间接血凝试验、琼脂扩散试验(,)、酶联免疫吸附试验(,)等。间接血凝试验操作简单,敏感性低,结果的判定需要一定的经验,且血凝
4、抗原的稳定性差、保存时间短。操作简便,敏感性低,需要及以上才能得到结果。对大批量血清样品进行快速检测时,这两种方法均存在一定的局限性。特异性强,敏感性高,适用于对大量血清样品的检测,但对检测人员的技术和设备有较高的要求。胶体金免疫层析技术是以胶体金为显色媒介,利用免疫学中抗原抗体能够特异性结合的原理,在层析过程中完成这一反应,从而达到检测的目的,其基本应用形式是胶体金检测试纸条(,),由于检测周期短、成本低、对仪器和人员没有特殊要求,在即时检测方面发挥着不可替代的作用,已广泛应用于动物疾病诊断等领域。本研究以胶体金标记兔抗鸭 喷涂金标垫,提取多杀性巴氏杆菌荚膜作为检测抗原,制备了检测鸭血清中抗
5、多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条(),经检验,特异性强,重复性好,敏感性高于,与 的总体符合率为 ,能满足现场快速检测抗体的需求,适合在基层推广应用。材料与方法材料试验菌株多杀性巴氏杆菌 ,购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。试剂粒径 的 胶体金溶液、样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜(膜)、吸收垫、底板和胶体金卡等,福州康和尔生物科技有限公司产品;兔抗鸭 抗体、羊抗兔 抗体,兰博利德(福州)生物技术有限公司产品;羊抗鸭 抗体,美国 公司产品;马丁氏琼脂、马丁氏肉汤,青岛高科技工业园海博生物技术有限DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.015公司产品;氯化钠、十二烷
6、基硫酸钠(),国药集团化学试剂有限公司产品;金标抗体保存液(含 、吐温 的 的 )、金标抗体稀释液(含 、蔗糖的 的 )、封闭液(含 的 、吐温 的 的 ),本实验室现配现用。从未发生过禽霍乱的种鸭场购买刚出壳雏鸭,隔离饲养,采血制备血清,琼脂扩散试验测定血清的抗体效价,结果为阴性,冰冻保存,作为阴性血清。鸭抗多杀性巴氏杆菌、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清,本实验室保存于 冰箱。主要仪器 型生物洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司产品;型恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司产品;型数显恒温水浴锅,青岛聚创环保集团有限公司产品;型高压灭菌器,日本 公司产
7、品;型 离 心 机,日 本 公 司 产 品;型酶标仪,美国 公司产品。方法 多 杀 性 巴 氏 杆 菌 荚 膜 的 提 取取 菌株的冻干粉,划线接种于马丁氏琼脂,培养过夜。挑取圆形露珠样的小菌落个,接种于马丁氏肉汤,培养过夜。每个马丁氏琼脂平板()接种培养液 ,培养过夜。采用 和 浸提法提取荚膜,以含 的 溶液洗下菌苔,水 浴并不断搅拌,冰 水 浴 冷 却 后 、离心 ,收集上清于蒸馏水中透析,每隔换水次,即为荚膜,采用 超微量分光光度计测定蛋白浓度。兔抗鸭 抗体的胶体金标记标记胶体金的抗体浓度筛选参考文献 方法,将兔抗鸭 抗体的浓度分别调整为、,用 的 溶液将胶体金溶液的 调为,将抗体与胶体
8、金溶液等量混合,室温下搅拌 ,静置 。各加入 溶液 ,继续搅拌 ,静置 。离心 ,取上清液测定其 值。将 值趋于稳定时对应的最小抗体浓度定为兔抗鸭 抗体的最佳浓度。抗体标记胶体金溶液 筛选将兔抗鸭 抗体的浓度调整为最佳浓度,用 的 溶液或 的 溶液将胶体金溶液的 调整为、,将抗体与胶体金溶液等量混合,室温下搅拌 ,静置 。各加入 溶液 ,继续搅拌 ,静置 。离心 ,取上清液测定其 值,以 值接近最大时对应的最小 为标记的最佳。金标抗体的大量制备用 的 溶液将胶体金溶液的 调整至最佳值,兔抗鸭 抗体调整为最佳浓度的倍,二者混合,室温下搅拌 ,静置 ,加入 使其终浓度为,继续搅拌 ,静置过夜。离
9、心 ,取 红 色 上 清 液,、离心 ,弃上清,沉淀用金标抗体保存液重悬至原体积的,保存。胶体金试纸条的组装金标抗体稀释倍数的确定金标抗体以金标抗体稀释液稀释倍,分别喷涂于金标结合垫上,烘干。荚膜和羊抗兔 抗体分别用 的 溶液调整为,喷涂于 膜上的相应位置,烘干。组装成检测试纸,检测鸭抗多杀性巴氏杆菌血清和阴性血清,比较显色情况,确定金标抗体的稀释倍数。荚膜和羊抗兔 抗体包被浓度的确定金标抗体以金标抗体稀释液进行倍稀释,喷涂于金标结合垫上,烘干。荚膜和羊抗兔 抗体,均以 的 溶液稀释为、,不同浓度组合后喷涂于 膜上的相应位置,烘干。组装成检测试纸,检测鸭抗多杀性巴氏杆菌血清和阴性血清,比较显色
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