种龄及接种量协同作用对纤维素酶活性的影响_贾洪柏.pdf
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1、种龄及接种量协同作用对纤维素酶活性的影响贾洪柏,许 超,刘 军,何 凡,丁宏云(安吉国千环境科技有限公司,浙江湖州;东北林业大学生命学院,黑龙江哈尔滨)摘要 目的分析菌种种龄和接种量的协同作用对纤维素酶活性的影响,为生产纤维素酶奠定理论基础。方法分别对单菌种()和混合菌种()不同种龄和接种量进行发酵培养试验,测定各处理的纤维素酶活力,分析不同处理纤维素的变化趋势及差异。结果在培养过程中,不同种龄的纤维素酶活力都在第 天达到最大;单菌种接种量为 和 时种龄 的纤维素酶活力最高,分别达到 和 ;混合菌种接种量为和时种龄 的纤维素酶活力最高,分别为 和 。在第 天时,相同菌种和接种量的不同种龄的纤维
2、素酶活力有一定差异。结论采用该研究的单菌或混合菌生产纤维素酶时,最优接种条件是种龄、接种量,可以获得较高的纤维素酶活力,并且生产成本较低。关键词 种龄;接种量;协同作用;纤维素酶;活性中图分类号 文献标识码 文章编号():开放科学(资源服务)标识码():,(,;,)()(),;基金项目 中央高校基本科研业务费专项资金项目()。作者简介 贾洪柏(),男,辽宁辽阳人,实验师,博士,从事环境微生物学和微生物遗传学研究。收稿日期 我国作为农业大国,每年都会产生几亿吨的秸秆,如果不能良好地利用秸秆资源,则会造成环境污染,影响人类健康。利用秸秆等纤维素原料生产燃料乙醇是目前研究的热点,其中利用纤维素酶将纤
3、维素转化为小分子有机物,是目前利用纤维素类物质的有效措施。燃料乙醇生产中存在的最大问题是如何降低生产成本,其中如何提高纤维素酶的产量是降低生产成本的一个重要因素。近年来,学者们从多方面对产纤维素酶的微生物进行了研究,包括产纤维素酶菌种的筛选、微生物菌种的诱变,如常温常压等离子诱变、紫外线诱变、亚硝基胍诱变等,以及利用分子手段提高微生物产纤维素酶等,并且取得了较好的结果。发酵工艺的发展最终都是为了提高发酵过程产物的产量。种子发酵阶段的优化被认为是最后发酵阶段优化提高培养物产量的补充。有大量的文献已经报道了发酵最后阶段优化提高最终发酵产物的例子。笔者针对液体种子种龄和接种量对纤维素酶()活性的影响
4、进行了研究,旨在为此方面的研究和生产奠定理论基础。材料与方法 试验材料 菌种。利用富集培养的方法从大庆野外分离得到的 株产纤维素酶镰刀菌属 和。柳枝草。采自东北林业大学大庆生物技术研究院的柳枝草种植基地。药品。购自天津市大茂化学试剂厂的分析纯试剂。纤维素分解菌初筛分离平板培养基。,(),蒸馏水 ,为,以滤纸为唯一碳源。羧甲基纤维素钠复筛选培养基。,蛋白胨 ,酵母膏 ,蒸馏水 ,琼脂 ,为。牛肉膏蛋白胨分离培养基。牛肉膏 ,蛋白胨,琼脂 ,蒸馏水 ,为。柳枝草液体培养基。,(),蛋白胨 ,尿素 ,碱处理后的柳枝草粉 ,蒸馏水 ,为。柳枝草粉的制备:将柳枝草剪成 的小段,用 的 溶液浸泡 ;用流水
5、冲洗后,将 调至中性,烘干;将烘干的小段粉碎至 目备用。种子液体培养基。同柳枝草液体培养基,将柳枝草粉改为羧甲基纤维素钠。安徽农业科学,():,试验方法 培养方法。向装有 种子液体培养基的 个三角瓶中一个接种菌株 两环,另一个接种菌株 与 各 环,在 、条件下振荡培养。分别于接种后的第 天、第 天、第 天、第 天、第 天取种子液按照体积比 和 的接种量分别接种到装有 柳枝草液体培养基中同条件下振荡培养,同时测定种子液菌种浓度。加入菌种后第 天测定 活力,连续测定 ,每个样品重复 次。酶 活 力 测 定 方 法。取 一 定 的 培 养 液 于 、离心 ,取上清液作为粗酶液测定酶活力。活力测定:取
6、经适当稀释的酶液 ,加入 含 的 的醋酸醋酸钠缓冲液,混匀,恒温水浴 ,加入 试剂,沸水中煮沸,后用流水冷却至室温,定容至 ,在 下比色,测出 值,查阅标准曲线后,求出溶液中的葡萄糖含量。以国际单位为依据,定义每分钟催化纤维素水解生成 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。试剂配制:称取 酒石酸钾钠,溶于一定量水中,加热溶解,添加 ,硝基水杨酸、氢氧化钠,溶解后加入 苯酚、无水亚硫酸钠,全部加热溶解后,冷却至室温,定容至 。用前 配制。数据统计分析 利用 软件对试验数据进行统计分析。结果与分析 种子浓度的变化 从各种龄种子浓度(图)可以看出,无论是单菌种()还是混合菌种()在培养过程中菌种浓度都是先升
7、高后降低,在种龄 时达到最高,单菌种的浓度达到,混合菌种的浓度达到了。图 单菌种()和混合菌种()各种龄种子浓度 ()()活力的变化趋势从不同菌种不同接种量的各种龄 活力变化趋势(图)可以看出,在整个的试验过程中,种龄 和种龄 在第 天时的 活力有一个小幅升高,而后降低再升高,在第 天时达到最高,然后再降低;种龄 和种龄 的 活力的变化趋势都是先升高,在第 天时达到最高,而后再降低。接种单菌种种龄 的 活力变化趋势与种龄 和种龄 相同,但是小幅增高的时间向后推迟到了第 天;接种混合菌种种龄 的 活力与种龄 的 活力在同一时间的变化趋势相同,即逐渐降低,再逐渐升高,在第 天时达到最高,而后逐渐降
8、低。韩美玲等研究发现糙皮侧耳在不同碳源条件下都表现出羧甲基纤维素酶活性升高降低升高的过程,这与该研究中种龄 和种龄 的 活力变化趋势相同。活力出现小高峰可能是菌体数量较少,并且适应性弱,在接种后种子液中易利用的营养成分促进了菌种的快速生长,从而使 活力升高;当这部分碳源消耗尽后,随着 对培养液中纤维素的作用,活力降低。但随着微生物数量的增加,活力又开始升高。不同种龄及接种量对 活力的影响 从试验中第天各处理的 活力(表)可以看出,以单菌种接种培养的 活力 种接种量(、)种龄 的 活力都最高,分别达 和 。以混合菌种接种培养的 活力,接种量为 时种龄 的 活力最高,达 ;接种量为 时种龄 的 活
9、力最高,达 。经方差分析和多重比较表明,试验第 天时,接种相同菌种和接种量的不同种龄处理的 活力有一定差异。从图 可以看出,种龄 的种子浓度最高,但在接种培养过程中的 活力普遍较低,这与孙宝婷等的研究结果相反。这可能是种子培养阶段与扩大培养阶段的培养基碳源不同导致的。接种带来的种子液中易利用的营养成分较少,接入新的培养液后,菌种生长缓慢,大量接种的微生物死亡或停滞,导致酶活力较低。师璐等研究发现,羧甲基纤维素钠是作为产纤维素酶最好的碳源。而种龄 和种龄 虽然菌种生长力较弱,但接种带来的种子液中易利用的营养成分相对较多,有利于微生物快速生长繁殖;虽然种龄 的种子液中易利用的营养成分也很少,但种子
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