终末期肝脏疾病细胞治疗的研究进展_彭蕾.pdf
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1、1 4 4CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESIS综述癌变畸变突变Vol.35No.2Mar.2023收稿日期:2022-08-08;修订日期:2023-01-30基金项目:国家自然科学基金(32070732);上海市启明星项目(21QA1411400)作者信息:彭蕾,E-mail:。*通信作者,王敏君,E-mail:终末期肝脏疾病细胞治疗的研究进展彭蕾1,王敏君2,*(1海军军医大学基础医学院,上海200433,2海军军医大学细胞生物学教研室,上海200433)【摘要】终末期肝病包括肝衰竭和失代偿期肝硬化等类型,临床表现为肝细胞功能异常而导致肝脏蛋白合
2、成、代谢等功能丧失。在我国,每年约有30万人死于终末期肝脏疾病。原位肝移植是治疗终末期肝病最为直接且有效的方式,但由于供肝资源短缺、免疫排斥和手术费昂贵等问题的存在,极大限制了其在临床上的广泛应用。细胞治疗是潜在的能够替代肝移植的唯一有希望的治疗方法,其主要是通过将体外获得的细胞移植入受体肝脏中,植入肝脏的外源细胞进行增殖并逐渐再殖受损肝脏从而实现损伤肝脏功能的修复。本文拟对有望成为细胞治疗的供体细胞如原代或诱导型肝细胞、肝脏干/前体细胞、间充质干细胞、肝脏类器官等细胞类型在动物实验和临床应用中取得的进展进行概述,为其应用于终末期肝脏疾病的临床治疗提供理论基础。【关键词】终末期肝病;细胞治疗;
3、肝细胞;成体干细胞;肝脏类器官中图分类号:R575.3文献标志码:A文章编号:1004-616X(2023)02-0144-04doi:10.3969/j.issn.1004-616x.2023.02.011肝移植是治疗终末期肝病最有效的手段,但由于供肝来源的限制1,我国每年能获得肝移植机会的患者仅为2 0002 500例。而且肝移植手术费用昂贵使得终末期肝病患者进行原位肝移植治疗的形势不容乐观,因此,急需找到其他的来源以获得更有效的肝脏再殖替代方案。细胞移植治疗就是将体外培养或者分离得到的细胞移植到受体肝脏,使其在受体肝脏中进行增殖并逐渐修复受损肝细胞,重构受体肝脏并恢复肝脏功能的一种治疗方
4、法。近年来,随着体外培养条件、培养基成分、培养技术等的发展,除了原代分离的肝细胞,其他种类的细胞如干细胞、诱导型肝细胞样细胞以及类器官细胞都展现了较好的修复损伤肝脏功能的潜力,本文拟对这些具有细胞治疗潜能的细胞按不同类型进行归纳和总结。1原代或诱导型肝细胞原代或诱导型肝细胞是指具有合成白蛋白、尿素等物质以及解毒代谢能力的细胞。原代肝细胞移植入受体肝脏后,不仅可在宿主肝脏内定植,还能够不断增殖并替代部分肝脏功能2。目前原代肝细胞主要取自不适合进行肝脏移植手术的供体肝脏。相比原位肝脏移植,肝细胞移植临床手术简单很多,大多采用门静脉或者股动脉进行细胞移植。而且,一个供体肝脏分离的肝细胞可以移植多位病
5、人,移植成本远低于原位肝移植,同时肝细胞移植的再殖效率是细胞移植治疗中最高的,能够在较短时间内替代损伤肝细胞而实现肝脏再殖从而有效地执行肝脏功能。大量的临床前和临床试验报道了肝细胞移植成功救治急慢性肝衰竭、威尔逊氏病、I型Crigler-Najjar综合征等一些遗传性代谢疾病患者案例3。然而肝细胞不能体外大量扩增,以及肝细胞冻存再复苏后细胞活力下降等问题,极大地限制了其在临床的广泛应用。近年来诱导型肝细胞用于治疗肝衰竭等肝脏疾病的研究越来越受到科学家关注。王红阳等4通过调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖去乙酰化酶SIRT
6、1等信号通路将小鼠成熟的肝细胞转化为肝祖细胞样细胞,可以在体外大量扩增且很容易转化为具有代谢功能的肝细胞,体内移植后再殖的细胞不仅表达白蛋白(albumin,ALB),且 能 提 高 延 胡 索 酰 乙 酰 乙 酸 水 解 酶(fumarylacetoacetatehydrolase,Fah)缺陷(Fah/)小鼠血清中ALB和1-抗胰蛋白酶含量,显著改善肝功能及小鼠生存率。研究显示TNF蛋白因子可以促进3D培养基中原代肝细胞的增殖,使得体外肝细胞的增殖周期长达6个月。而且长期培养后的肝细胞移植到Fah/小鼠后仍可快速修复小鼠受损肝脏5。惠利健等6建立了一种新的培养体系,可使得肝细胞既保持肝细胞
7、特征又获得干细胞的特征,能够实现体外大量扩增。新体系下获得的肝细胞移植到急性肝衰竭大鼠肝脏后约有50%的大鼠存活了7 d以上。Kim等7利用小分子化合物将人肝细胞重编程为肝前体细胞,使其至少能体外扩增多达10代,将肝前体细胞移植入肝损伤小鼠模型脾内还能够有效再殖肝脏。TGF-b和Notch通路抑制剂处理获得的诱导型肝细胞移植到急性肝损伤小鼠后发现约半数的小鼠存活了至少7 d以上8。除此之外,邓宏魁等9在其建立了二维肝细胞长期培养的基础之上,建立了一个高效诱导人多能干细胞向其衍生的肝球体分化模型,能够稳定生产大量功能的肝综述癌变畸变突变1 4 5CARCINOGENESIS,TERATOGENE
8、SIS&MUTAGENESIS2023 年 3 月第 35 卷第 2 期细胞库为未来肝衰竭治疗提供足够的细胞来源。2肝脏干/前体细胞成体肝脏干细胞或胚胎肝前体细胞是一类具有高度增殖特性并可分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的细胞类群10。研究显示来自人胚胎的肝前体细胞可以成功植入肝硬化的免疫缺陷小鼠并实现肝脏功能的恢复11。在巴勒莫伊斯米特和匹兹堡大学联合开展的一项20092015年临床试验中,采用人胎肝前体细胞进行细胞移植以治疗失代偿性肝脏疾病(http:/www.clinicaltrials.gov,编号NCT01013194)。一项回顾性病例报告指出胚胎肝前体细胞移植治疗后的9例终末期肝病患
9、者临床表征得到明显缓解12。成体肝干细胞主要分布于肝内赫令氏管、胆周腺以及肝外胆管中。通过成体肝干细胞标志物Lgr5、Foxl1和Hnf1等建立的谱系示踪小鼠研究表明,当肝脏发生损伤时,肝干细胞可以分化为肝细胞或胆管细胞来挽救肝脏功能13。成体肝干细胞可以体外扩增,以满足体内移植的细胞数量。研究报道显示,11062106个细胞经脾脏移植入四氯化碳及千里光碱处理的肝损伤小鼠模型中,移植的肝干细胞可以在体内分化为表达白蛋白的成熟细胞14。同样,肝干细胞移植入肝细胞损伤小鼠模型后,结果显示5106个细胞移植后可实现15%的肝脏再殖效率15。大鼠肝细胞诱导变为肝前体细胞后,移植入uPA小鼠后可再分化为
10、成熟肝细胞,并实现75%90%的肝脏再殖效率16。我们课题组也成功将小鼠成纤维细胞重编程为肝干细胞,重编程产生的肝干细胞不仅能够体外大量扩增,且具有体内外肝细胞和胆管细胞分化能力。且将重编程产生的肝干细胞直接移植入Fah/小鼠后也能够成功再殖损伤肝脏并实现肝脏功能修复17。最新研究显示通过4个小分子化合物可成功诱导肝脏内源性肝细胞产生,从而缓解自身肝纤维化现象18。3间充质干细胞间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源于骨髓、脐带、胎盘、脂肪、外周血及肌肉等组织,表达CD73、CD90和CD105等特异性表面标志物。MSCs是一类多潜能干细胞,能够分化为成骨细
11、胞、脂肪细胞甚至肝细胞,因此应用广泛。大量研究显示骨髓间充质干细胞移植可以有效治疗肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病19。如人脂肪来源的间充质干细胞肝内移植硫代乙酰胺诱导的慢性肝损伤大鼠模型1周后可分化为表达白蛋白的肝细胞20。猪来源的间充质干细胞注射入四氯化碳诱导的急性肝衰竭小鼠后,明显降低小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、直接胆红素(DBiL)和总胆红素(TBiL)水平而提高ALB蛋白含量,提高小鼠存活率,有效改善四氯化碳诱导导致的小鼠急性肝衰竭现象21。骨髓间充质干细胞移植后可防止肝移植者缺血再灌注损伤,提高其生存能力22。在D-半乳糖胺(D-gal)诱导的猪急性肝衰
12、竭模型中,3106个细胞每千克剂量的人骨髓间充质干细胞静脉移植后即可有效缓解肝衰竭,并且能够在体内分化为成熟肝细胞23。因间充质干细胞获取容易、免疫源性低等优势,目前为止干细胞应用于肝病的临床治疗主要都是以间充质干细胞为主。目前,在临床试验网站(http:/www.clinicaltrials.gov)上有超过50项正在进行的MSCs治疗不同种类肝脏疾病的临床试验。在我国,解放军第302医院、中山大学第三附属医院、河海大学第一附属医院等多所医院开展了脐带间充质干细胞治疗重症肝病的临床研究。这些临床研究已表明通过移植MSCs治疗肝衰竭可明显改善患者临床症状、肝功能指标和终末期肝病模型评分,提高患
13、者近期生存率。然而根据国家食品药品监督管理总局网站的信息(http:/),间充质干细胞作为治疗终末期肝病的药物仍未获批进入临床应用,可能原因是MSCs在体内分化为肝细胞的效率非常低,从而可能是通过旁分泌作用抑制炎症介质分泌、调节免疫反应等来改变宿主肝损伤的应答而促进肝脏功能的恢复。如扁桃体来源MSC培养的上清液注射入纤维化肝脏后可显著降低肝脏炎症和胶原蛋白的表达24。同样间充质干细胞来源的外泌体也能够降低CCl4诱导肝纤维化,抑制胶原蛋白的合成并促进肝脏再生25。4肝脏类器官类器官是在体外利用3D技术对多能干细胞或成体干细胞进行培养而自身聚合形成的三维组织结构,可包含多种细胞类型,结构上与原生
14、器官相类似并能够重现原生器官的部分功能,从而提供一个高度生理相关的系统。2013年,来自欧洲及日本的课题组分别报道了应用LGR5干细胞及诱导多能干细胞构建了肝类器官的培养方案13,26,开启了肝类器官的研究。2015年,Huch等14在LGR5肝类器官培养体系上,通过添加DAPT、BMP7等因子诱导类器官偏向成熟肝细胞功能,结果显示肝细胞标志物ALB和CYP3A4的明显上调,移植到四氯化碳急性肝损伤小鼠中714 d后,约有5/6的小鼠开始稳定表达的人白蛋白和a-1-抗胰蛋白酶,并持续了60 d。Takebe等27通过人诱导多能干细胞诱导产生的包含内胚层细胞、间质细胞等混合细胞培养,所得类器官表
15、达较为成熟的肝样细胞特性,移植到免疫缺陷小鼠后能有效提高小鼠血清中白蛋白含量。Wang等28通过对培养基条件的改善建立了人类ESC衍生的可扩展肝类 器 官(humanESC-derived-expandablehepaticorganoids,hEHOs)。hEHOs表现了肝干细胞的表型特征,也可分化为功能性肝细胞或胆管细胞,并能扩增近20代。hEHOs移植入肝脏损伤的免疫缺陷小鼠后能在体内分化为成熟的肝细胞。结果显示,对照组小鼠在肝损伤五周内均死亡,而hEHOs移植后有2/3的小鼠存活时间超过3个月。2018年,Hu等29建立了人胚胎肝细胞和成熟肝细胞的类器官。建立的肝细胞来源类器官保持了与
16、成体肝细胞形态、细胞结构、基因表达特征和生理功能的高度一致,并可稳定传代数月,而且可以实现小鼠肝脏内的再殖。除了肝内胆管细胞可以产生干细胞类器官外,肝外胆管系统也可以产生具有干细胞特性的类器官。肝外胆管来源类器官产生可以解决干细胞肝内获取途径难以及数量少的问题,目前已有研究团队成功培养出了小鼠肝外胆管来源类器官,其在体外可以稳定增殖,且冻存复苏后细胞仍保持高活力30。尽管研究报道人肝外胆管类器官分化为肝细胞的效率非常低,难以应用于肝细胞功能缺失的肝脏疾病31。但是,肝外胆管来源类器官却能够治疗胆管损伤的肝脏疾病32。综述癌变畸变突变1 4 6CARCINOGENESIS,TERATOGENES
17、IS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.20235总结目前为止,利用各种细胞治疗肝衰竭疾病的手段已初步验证具有一定的有效性和安全性。但每种方案均有一定的限制性:制约原位肝细胞手段发展的最大阻力为供体来源少,诱导型肝样细胞的诱导效率低,培养诱导周期长;制约干细胞手段发展的最大阻力为再殖效率低,且部分干细胞的应用存在安全问题和伦理问题;制约生物人工肝手段发展的最大瓶颈为其治疗的暂时性而非永久性;制约类器官发展的最大问题为基质胶支持体系有动物源成分以及大规模培养条件不成熟。若能综合以上手段,通过研究得到一种体外细胞来源广,并且再殖效率高的细胞培养方案,不仅可以在基础研究领域拓展细胞培
18、养的知识体系,而且可以有效解决肝脏疾病治疗中肝细胞的来源问题,救治更多的肝衰竭病人,具有极大的临床应用价值。参考文献1IANSANTE V,MITRY R R,FILIPPI C,et al.Human hepatocytetransplantation for liver disease:current status and future perspectivesJ.Pediatr Res,2018,83(1/2):232-240.2HUEBERT R C,RAKELA J.Cellular therapy for liver diseaseJ.MayoClin Proc,2014,89(3
19、):414-424.3WANG F,ZHOU L,MA X,et al.Monitoring of intrasplenic hepatocytetransplantation for acute-on-chronic liver failure:a prospective five-year follow-up studyJ.Transplant Proc,2014,46(1):192-198.4FU G B,HUANG W J,ZENG M,et al.Expansion and differentiation ofhuman hepatocyte-derived liver progen
20、itor-like cells and their use forthe study of hepatotropic pathogensJ.Cell Res,2019,29(1):8-22.5PENG W C,LOGAN C Y,FISH M,et al.Inflammatory cytokine TNFpromotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D cultureJ.Cell,2018,175(6):1607-1619.e15.6ZHANG K,ZHANG L D,LIU W M,et al.In vitro exp
21、ansion of primaryhuman hepatocytes with efficient liver repopulation capacityJ.CellStem Cell,2018,23(6):806-819.e4.7KIM Y,KANG K,LEE S B,et al.Small molecule-mediatedreprogramming of human hepatocytes into bipotent progenitor cellsJ.JHepatol,2019,70(1):97-107.8FENG S S,WU J Y,QIU W L,et al.Large-sca
22、le generation offunctional and transplantable hepatocytes and cholangiocytes fromhuman endoderm stem cellsJ.Cell Rep,2020,33(10):108455.9CHEN S T,WANG J L,REN H Z,et al.Hepatic spheroids derived fromhuman induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescueporcine acute liver failureJ.Cell
23、Res,2020,30(1):95-97.10 KO S,RUSSELL J O,MOLINA L M,et al.Liver progenitors and adultcell plasticity in hepatic injury and repair:knowns and unknownsJ.Annu Rev Pathol,2020,15:23-50.11 IRUDAYASWAMY A,MUTHIAH M,ZHOU L,et al.Long-term fate ofhuman fetal liver progenitor cells transplanted in injured mo
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