猪非典型瘟病毒云南株Mut...胞NF-κB转录活化的影响_何维琪.pdf
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1、动物医学进展,():猪非典型瘟病毒云南株 蛋白的特征分析及其对宿主细胞 转录活化的影响收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:何维琪(),女(白族),云南大理人,硕士研究生,主要从事分子生物学研究。通讯作者何维琪,姜光飞,高艺,梁龙舟,杨玉艾,孙永科(云南农业大学动物医学院,云南昆明 )摘要:猪非典型瘟病毒()是近年来新发现的猪病毒性病原,给养猪业健康发展带来了严重的威胁。课题组前期研究发现了 云南株()导致感染猪临床症状非典型化的关键基因 ,为探讨 的生物学特征及其对宿主细胞 信号通路转录活化的影响,揭示 非典型化的机制。利用 、等在线软件对 基因表达蛋白的理化性质、亚细胞定位
2、、磷酸化位点等进行分析预测;将重组载体 转染至 细胞,确定蛋白稳定表达后利用 刺激 信号通路使其活化,分析 对 转录活性及其对 核质转运的影响。生物信息学分析结果显示,蛋白为亲水性的稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,可能主要定位于细胞质,二级结构主要以无规则卷曲为主,三级结构稳定,可能作用于 、等相关激酶及蛋白受体;蛋白在 细胞成功表达,大小约为 ;对 激活的 转录活化有明显抑制作用,干扰 的入核,抑制核质穿梭过程。研究结果为后续进一步在分子水平上探究 在 非典型化中的作用奠定了基础。关键词:猪非典型瘟病毒;生物信息学;蛋白;转录活性;中图分类号:;文献标识码:文章编号:()猪非典型瘟病毒(,)是
3、引起仔猪先天性震颤(型)的主要病原之一,是单股正链 病毒,与猪瘟病毒(,)同属瘟病毒,被归类为瘟病毒属。年美国首次报道 以来,受到了越来越多的关注。感染猪只出现持续性带毒、母猪繁殖障碍、新生仔猪先天性感染和免疫耐受等临床表现,与 感染猪相比呈现非典型临床表现,对 的感染和致病机制尚缺少深入研究。课题组前期分离得到株 云南株()。研究发现,对信号通路 有抑制作用,基因组 位变异是导致非典型化的关键基因,并将 基因组 位基因命名为 ,因此推测 可能是导致 感染后临床症状非典型化的关键基因。属于核转录因子家族,广泛存在于真核细胞中,对 内 源 性 免 疫 的 启 动 和 调 节 起 关 键 作用 。
4、激活是免疫活化的早期基本步骤和标志,通过与细胞核内的特异性 调节序列结合,控制多种与凋亡、免疫及炎症反应和细胞增殖相关基因的表达 。多数病毒为保证自身在宿主细胞中正常复制,进化出了针对 信号通路独特的调节宿主免疫应答的能力。病毒为了能更好的在宿主体内复制与感染,会不断发生变异,产生抑制 信号通路的作用机制,这可能与病毒免疫逃避相关。对 的功能及其是否影响宿主细胞 信号通路,以及 导致 感染后临床症状非典型化是否与 信号通路有关尚不清楚。为此,本研究拟对 基因表达的蛋白进行生物信息学分析,并将重组真核表达载体 转染 细胞,在 的刺激下激活 信号通路,分析 对 转录活性的影响,为进一步研究 在 感
5、染后造成临床症状非典型化的致病机制中的作用提供参考。DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.002材料与方法材料细 胞、重 组 表 达 载 体 及 报 告 基 因 质 粒 细胞和表达 重组真核表达载体 ,云南农业大学动物医学院分子病原学实验室保存;报告基因质粒 和 ,丰晖生物科技有限公司产品。主要试剂胎牛血清、培养基、高糖培养基,公司产品;鼠抗 标签单抗,天根生化科技(北京)有 限公司产 品;转染试剂、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 ()、化学发光底物、肿瘤坏死因子()、双萤光素酶报告基因检测试剂盒、核转运检测试剂盒,碧云天生物技术(上海)有限公司产品。主要仪器设备倒
6、置荧光显微镜,明美光电有限公司产品;二氧化碳恒温培养箱,美墨尔特贸易有限公司产品;电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;凝胶成像系统,美国 公司产品。方法 表达产物的特征分析用 将 株的 基因翻译成氨基酸序列;用软件 (:)分析该基因表达的蛋白的理化性质,预测蛋白分子质量、理论等电点及氨基酸组成等;用软件 (:)预测蛋白的二级结构;用软件 (:)预测蛋白的跨膜结构域;用软件 (:)预测蛋白的信号肽;用 软 件 (:)预 测 蛋 白 的 亲 疏 水 性;用 软 件 (:)预测蛋白的三级结构;用软件 预测蛋白的亚细胞定位;用软件 (:)预测蛋白的磷酸化位点。重组质粒 的 蛋白表达检测重组质粒 使用
7、无内毒素质粒小提试剂盒提取 并 检 测 浓 度 备 用。将 生 长 状 态 良 好 的 细胞在转染前于孔板中铺板,每孔接种细胞约 个,置 、体积分数为的 培养箱中,待细胞生长至 铺满孔底时进行转染(参照 转染试剂说明书,设置空白对照组、空载体对照组 和试验组 ),继续培养 后按 裂解液说明书提取蛋白,用鼠抗 标签单抗作为一抗,山羊抗鼠 作为二抗,进行 检测 蛋白表达(表)。检测 蛋白对宿主细胞 转录活化的影响检测 相对荧光素酶活性取生长状态良好的 细胞接种于 孔板,每孔各加入细胞液 ,细胞数约为,放回细胞培养箱培养至细胞融合度约达到 时转染。转染前每孔换 新鲜培养液,利用 转染试剂转染,设置空
8、白对照组(常规培养液)、空载体对照组()和试验组(),试验组质粒按浓度梯度分为组(、孔),每组分别设置个重复孔,与 萤火虫荧光素报告质粒 和海肾荧光素内参质粒 共转染至 细胞,转染体系见表,放回 、体积分数为的 恒温培养箱中继续培养。转染后,每组孔中加入浓度为 的 ,使其终浓度为 ,另外孔加入等体积的 稀释液作为对照。继续培养约 后,用碧云天双萤光素酶报告基因检测试剂盒处理各组细胞,用荧光检测仪检测并记录每组的萤火虫荧光和海肾荧光,计算萤火虫荧光与海肾荧光的比值,使用 对每组细胞相对荧光值做统计学分析。表重组质粒与报告基因质粒的共转染体系 组别 体系 试 验 组 空载体对照组 空 白 对 照
9、组 间接免疫荧光法检测 蛋白的入核情况按的转染方法,分别设置试验组、空载体对 照 组 和 空 白 对 照 组,将 各 组 质 粒 转 染 至 细胞,继续培养 后加入终浓度为 的 刺激,分别在刺激、后,吸除培养液,用 冲洗次,每孔细胞加入固定液固定 ;随后用免疫染色封闭液室动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)温封闭;封闭结束后加入 小鼠单抗,孵育过夜;次日吸出一抗,用 洗涤次,每次 ;加入抗小鼠 ,室温避光孵育;结束后吸出二抗,再次洗涤细胞,加入细胞核染色液(),室温染色 ,滴加适量抗荧光淬灭封片液后在倒置荧光显微镜下观察 的入核情况。结果 蛋白的特征预测 蛋白的理化性质预测利用在线软件 对
10、蛋白进行理化性质预测,结果显示,蛋白分子量大小约 ;理论等电点为,带负电荷残基总数()为,带正电荷残基总数()为;化学式是 ,原子总数为 ;在哺乳动物细胞的半衰期预测为,酵母体内,大肠埃希氏菌中;不稳定指数为 ,总平均亲水性为 ,说明 蛋白为亲水性的稳定蛋白(表);该蛋白氨基酸总数为 ,其中亮氨酸占,含量最高,色氨酸和谷氨酰胺各占,含量最低(表)。表 蛋白理化性质预测 基本性质 氨基酸数 分子质量 分子式 原子总数 理论等电点 负电荷残基总数 ()正电 荷 残 基 总 数 ()估计 半 衰 期 哺乳动物网状细胞,体 外 ,酵母,体内 ,大肠埃希氏菌,体内 ,不稳定指数 脂肪族指数 总平 均 亲
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