基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制.pdf
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1、广 东 药 科 大 学 学 报Journal of Guangdong Pharmaceutical UniversityJul,2023,39(4)收稿日期:2023-04-04基金项目:国家重点研发计划“中医药现代化研究重点”专项(2018YFC1707100);广东省重点领域研发计划项目(2020B1111120002);广东省中医药局科研项目(20221214);广东省医学科学技术研究基金项目(B2017098)作者简介:姜帆(2000),男,2022级在读硕士,研究方向:中药炮制原理与饮片质量标准化研究,Email:通信作者:王秋红(1969),女,教授,主要从事中药炮制原理与饮片质
2、量标准化研究,Email:。基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制姜帆1,李慧敏1,林婉娜1,洪菲惠2,陈雨婵2,彭东辉2,曾元宁1,王长福1,王秋红1,2(1.广东药科大学中药学院/广东省中药饮片规范化炮制工程技术研究中心,广东 广州 510006;2.黑龙江中医药大学/教育部北药基础与应用研究重点实验室/黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040)摘要:目的 基于网络药理学及动物实验验证黄芪桂枝五物汤(HGWD)治疗类风湿关节炎(RA)作用机制。方法 采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP),结合吸收(absorption)、分布
3、(distribution)、代谢(metabolism)和排泄(excretion)功能筛选HGWD主要活性成分并预测其靶点;通过GeneCards、DrugBank、DisGeNET数据库获取RA主要靶点,利用String平台进行药物疾病交集靶点蛋白相互作用分析;采用Metascape平台分析药物靶点与疾病基因交集,筛选HGWD治疗RA的潜在靶点、生物过程及潜在通路。利用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-靶点-通路”网络图。SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组、HGWD组,模型组用牛CII 胶原溶液与弗氏佐剂CFA(或IFA)造模,通过记录大鼠关节炎指数,HE染色检测大鼠踝关
4、节病理形态变化,ELISA法检测HGWD血清炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-)、白介素-1(IL-1)及白介素 6(IL-6)的影响,蛋白免疫印迹法验证靶点蛋白的表达。结果 网络药理学共筛选出HGWD活性成分共39个,其作用靶点共275个,与RA疾病交集靶点共为183个;其中经筛选得到关键靶点AKT1、TNF-、MAPK1、STAT3及IL-6等。动物实验结果表明与模型组比较,HGWD治疗组能够缓解RA的滑膜增生和炎症,减轻大鼠脚部肿胀程度;HGWD可抑制炎症因子TNF-、IL-1及IL-6表达,并且可下调JAK2、STAT3蛋白表达水平。结论 通过网络药理学及动物实验表明HGWD可通过参与JA
5、K2、STAT3免疫炎症相关通路发挥治疗RA作用。关键词:网络药理学;类风湿关节炎;黄芪桂枝五物汤;JAK2/STAT3信号通路中图分类号:R285文献标识码:A文章编号:2096-3653(2023)04-0049-10DOI:10.16809/ki.2096-3653.2023040401Study on mechanism of Huangqi Guizhi Wuwu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritisbased on network pharmacologyJIANG Fan1,LI Huimin1,LIN Wanna1
6、,HONG Feihui2,CHEN Yuchan2,PENG Donghui2,ZENG Yuanning1,WANGChangfu1,WANG Qiuhong1,2*(1.School of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Engineering TechnologyResearch Center for Standardized Processing of Chinese Materia Medica,Guangzhou 510006,China;2.Heilongjia
7、ngUniversity of Chinese Medicine,Key Laboratory of Northern Medicine Foundation and Application under Ministry of Education,Heilongjiang Key Laboratory of Traditional Chinese Pharmacodynamic Material Base,Harbin 150040,China)*Corresponding author Email:Abstract:Objective To explore the effect of Hua
8、ngqi Guizhi Wuwu Decoction(HGWD)in the treatment ofrheumatoid arthritis(RA)based on network pharmacology and animal experiments.Methods The systemspharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine(TCMSP),combined with absorption,distribution,metabolism and excretion functio
9、ns,was used to screen the main active components of HGWD and广东药科大学学报第39卷predict its targets.The main targets of RA were obtained through GeneCards,DrugBank,and DisGeNET databases,and the String platform was used for protein interaction analysis of drug disease intersection targets.TheMetascape platf
10、orm was used to analyze the intersection of drug targets and disease genes,and to screen forpotential targets,biological processes and potential pathways for the treatment of RA by HGWD.The drug-target-pathway network diagram was built by using Cytoscape3.7.2 software.SD rats were randomly divided i
11、nto thenormal group,the model group,positive drug group and HGWD group.The model group was modeled by usingbovine CII collagen solution and Freunds adjuvant CFA(or IFA).The arthritis index of the rats was recorded,HEstaining was used to detect pathological changes in the ankle joint of the rats,ELIS
12、A was used to detect TNF-,IL-1 and IL-6,and western blotting was used to verify the expression of target proteins.Results A total of 39 activeingredients of HGWD were screened in network pharmacology,with a total of 275 targets of action and 183targets that intersect with RA diseases.Among them,the
13、key targets AKT1,TNF-,MAPK1,STAT3 and IL-6were screened.Compared with the model group,HGWD treatment alleviated synovial hyperplasia andinflammation in RA,and reduced the degree of foot swelling in rats.Meantime,HGWD inhibited the expressionof inflammatory factors TNF-,IL-1 and IL-6,and down-regulat
14、ed the expression of JAK2 and STAT3 proteins.ConclusionHGWD can exert therapeutic effects on RA by participating in JAK2 and STAT3 immuneinflammation related pathways based on network pharmacology and animal experiments.Key words:network pharmacology;rheumatoid arthritis;Huangqi Guizhi Wuwu Decoctio
15、n;JAK2/STAT3signaling pathway类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一类病因复杂、以慢性滑膜炎为症状的慢性系统性疾病。其特征是手、足小关节的对称性、侵袭性关节炎症,常伴有关节外器官受累,严重可致关节畸形及功能丧失。研究1指出滑膜组织是一种位于关节腔内的膜性器官,在RA的关节破坏中起关键作用。黄芪桂枝五物汤(Huangqi Guizhi Wuwu Decoction,HGWD)出自 金匮要略,由黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣组成,具有和血痛痹、益气温经的功效。研究表明 HGWD可有效改善 RA引起的关节肿胀和晨僵时间等症状2-3,但HGWD治疗
16、RA的作用机制尚无系统阐明4。因此,本研究通过网络药理学预测HGWD治疗RA的主要靶点及生物工程,并通过动物实验验证 HGWD治疗 RA的相关作用靶 点,揭 示 了 HGWD 治 疗 RA 的 作 用 机 制,为HGWD的临床应用奠定基础。1 材料与方法1.1 材料与仪器黄芪、桂枝、白芍(购自圻晖药业有限公司,批号为2009271、2009272、2009273);大枣、生姜(购自广州清平中药材市场,批号为 2009271、2009274),经广东药科大学王长福副教授鉴定符合2020年版中国药典 规范;牛型胶原溶液(美国Chondrex公司,批号20022);完全弗氏佐剂(complete F
17、reunds adjuvant,CFA)、弗氏不完全佐剂(Freunds Incomplete Adjuvant,IFA)(美国Sigma公司,批号F5881、F5506);甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)(上海上药信谊药厂有限公司,批号 036200301);大鼠 IL-1、IL-6、TNF-酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司,货号分别为MM-0046R1、MM-0190R1、MM-0195R1);GAPDH 一抗(上海碧云天生物技术有限公司,批号 AF1282、AF1186);STAT3一抗(上海碧云天生物技术有限公司,批号AF1492);JAK2一抗
18、(武汉博士德生物工程有限公司,批号 BM4165)、HRP 标记的山羊抗小鼠抗体、HRP 标记的山羊抗兔抗体、BCA 蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司,批号 A0216、A0208、P0012);HE染液(武汉塞维尔生物科技有限公司,批号G1003)。Milli-QadvantageA10超纯水系统(广州皇河科技有限公司);Chem Studio PLUS超敏多功能成像仪(德国analytikjena耶拿公司);DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)等。1.2 动物饲养与造模56周龄 SPF级 SD雄性大鼠 50只,购于广东省医学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(粤)2
19、018-0002,饲养于广东省医学实验动物中心SPF级别实验环境,适应性喂养1周后开展实验,实验通过广东省医学实验动物中心伦理委员会审查,编号为C202112-04。大鼠经适应性喂养后,随机选取8只作为空白对照组,余下建立胶原诱导型(collagen-inducedarthritis,CIA)模型5,将牛CII 胶原溶液与 CFA(或50第4期姜帆,等.基于网络药理学探究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿性关节炎的机制IFA)低温等比例混合,第1次免疫在大鼠尾部选取3点皮下注射 0.2 mL牛 CII+CFA,第 2次免疫于第 1次注射 8 d 后在尾部不同部位皮下注射 0.1 mL 牛CII+IFA。
20、第2次免疫后每周进行关节炎指数AI评分,并做记录。1.3 黄芪桂枝五物汤的配制取黄芪、桂枝、白芍、大枣、生姜药材饮片,按照质量比为3 3 3 4 6的比例混合后,加入至10倍量的去离子水中浸泡30 min,煎煮3 h,重复2次,合并煎液,减压浓缩得到质量浓度为 2.0 g/mL 的煎煮液,-20 C保存备用。1.4 动物分组及给药大鼠建立CIA模型后,以关节炎指数评分AI3判断造模是否成功。将24只造模成功的大鼠随机分为3组:模型组(CIA)、甲氨蝶呤组(MTX)、黄芪桂枝五物汤(HGWD)组。另设正常组,每组 8只。根据 医学实验动物学 中实验动物给药用量6,采取大鼠灌胃给药,甲氨蝶呤给予
21、0.13 mg/(kgd),HGWD组给予黄芪桂枝五物汤5.13 g/(kgd),正常组及模型组每日给予同等剂量生理盐水,给药28 d。1.5 关节炎指数AI评分关节炎指数AI评分以大鼠两后足累计评分为总分,评分标准见表1。1.6 病理切片检测大鼠踝关节4%()多聚甲醛中固定,10%()乙二胺四乙酸脱钙2个月,各梯度乙醇及二甲苯脱水透明,置于二甲苯和石蜡中透蜡进行包埋,4 m切片进行染色后中性树脂封片,在光学显微镜下观察其组织病理形态变化。1.7 ELISA检测大鼠血清中指标含量取大鼠血清,按照ELISA试剂盒的说明书,测定大鼠血清中的IL-1、IL-6、TNF-水平。1.8 黄芪桂枝五物汤活
22、性成分收集及潜在靶点预测通过中医药系统药理平台TCMSP寻找黄芪桂枝五物汤5味中药化学成分,根据口服利用度(oralbioavailability,OB)30%且类药性(drug-likeness,DL)0.18进行活性成分靶点筛选以获得活性化合物及其作用的蛋白的靶点,并根据已有文献对活性化合物靶点进行补充。得到活性成分后,利用Uniprot 蛋白质数据库(https:/www.uniprot.org)对活性成分靶点进行标准化处理8-9。1.9 RA相关靶点预测以“Rheumatoid arthritis”、“RA”为关键词,借助GeneCards 数据库10(https:/www.genec
23、ards.org)、DRUGBANK数据库11(https:/www.drugbank.ca)和DisGeNet 数据库12(https:/www.disgenet.org)寻找疾病靶点。在GeneCards数据库中,Score值越高代表该靶点与疾病联系越密切,合并3个数据库的靶点后,删除重复基因,即可得到RA疾病靶点。1.10 黄芪桂枝五物汤治疗潜在治疗靶点的筛选绘制韦恩图,得二者交集靶点,而后将交集靶点提交至STRING11.0数据库构建蛋白互作(proteinprotein interaction network,PPI)网络,将生物种类设为“Homo sapiens”,最小互作用阈值设
24、定为“highest confidence”(0.9),其余为默认设置。导出结果保存为TSV文件,将其导入Cytoscape 3.7.2软件,对该网络进行拓扑分析。其中节点的大小、颜色的深浅变化代表度值的大小,并根据节点的度值筛选出核心靶点13。1.11黄芪桂枝五物汤治疗RA潜在靶点的生物过程分析将 HGWD 治 疗 RA 的 靶 点 录 入 Metascape(http:/metascape.org/gp/index.html)平台,对HGWD与 RA 疾病共有的关键靶点进行基因本体(geneontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopedia of gen
25、es and genomes,KEGG)分析,研究其治疗RA的作用靶点及相关信号通路分析,根据校正后P值,P值越小,显著性越强,筛选出相关性前20的分子功能及KEGG通路14。1.12黄芪桂枝五物汤治疗RA靶点与通路网络图的构建将以上筛选结果录入到 Cytoscape3.7.2 构建HGWD 活性成分-靶点-通路网络图,利用 CytoScape3.7.2 内置工具分析有效成分及靶点的网拓扑参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。1.13 Western blot验证靶点蛋白取大鼠膝关节滑膜组织,加入RIPA裂解液,冰上裂解后,12 000 r/min,离心 30 min,取上清。经BCA法测
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