利多卡因调节HMGB1_TLR4信号通路对慢性心力衰竭大鼠的心脏保护作用.pdf
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1、广 东 药 科 大 学 学 报Journal of Guangdong Pharmaceutical UniversityJul,2023,39(4)收稿日期:2023-04-17基金项目:四川省卫生和计划生育委员会科研课题(21PJ128)作者简介:冯昌盛(1973),男,博士,副主任医师,主要从事麻醉及疼痛分子生物学机制研究,Email:。利多卡因调节HMGB1/TLR4信号通路对慢性心力衰竭大鼠的心脏保护作用冯昌盛,钱朵,耿媛(川北医学院附属医院,四川 南充 637000)摘要:目的 探讨利多卡因调节高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)信号通路对慢性心力衰竭大鼠
2、的心脏保护作用。方法 将大鼠分为正常组、模型组、利多卡因低剂量组、利多卡因高剂量组和EP(HMGB1抑制剂)组,采用异丙肾上腺素皮下注射制备慢性心力衰竭大鼠模型。超声检测各组大鼠心功能;ELISA试剂盒测定血清心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-(TNF-)水平变化;HE染色和Masson染色观察大鼠心脏组织病理学变化;RT-qPCR检测HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA表达;Western blot检测HMGB1、TLR4、NF-B、p-NF-B、Bcl-2、Bax相关蛋白表达。结果 正常组大鼠HE染色结果显示心肌细胞形态结构正常,Masson
3、染色结果显示心肌组织致密有序排列,组织间没有胶原蛋白沉积。与正常组相比,模型组大鼠心肌细胞褶缩,形态结构排列不规则,有较多炎性细胞浸润,组织间有大量胶原蛋白沉积,心肌纤维化程度较重,大鼠左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)水平、心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、IL-1 和 TNF-水平、HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA水平、HMGB1、TLR4、p-NF-B/NF-B、Bax蛋白表达水平显著升高,左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)水平、Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P0.05);与模型组相比,利多卡因低、高剂量组和EP组大鼠心肌细胞损伤
4、显著改善,心肌组织中胶原蛋白显著减少,心肌纤维化程度显著减轻,大鼠LVEDD、LVESD、ANP、BNP、IL-1 和 TNF-水平、HMGB1 mRNA 和 TLR4 mRNA 水平、HMGB1、TLR4、p-NF-B/NF-B、Bax蛋白表达水平显著降低,LVEF和LVFS水平、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05)。结论 利多卡因可抑制HMGB1/TLR4信号通路,降低慢性心力衰竭大鼠的炎症损伤,改善其心功能。关键词:利多卡因;HMGB1/TLR4信号通路;慢性心力衰竭中图分类号:R965文献标识码:A文章编号:2096-3653(2023)04-0026-06DOI:10.168
5、09/ki.2096-3653.2023041701Study on the cardioprotective effect of lidocaine on chronic heart failure in rats by regulating theHMGB1/TLR4 signaling pathwayFENG Changsheng*,QIAN Duo,GENG Yuan(Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China)*Corresponding author Email:Abstrac
6、t:Objective To investigate the cardioprotective effect of lidocaine on chronic heart failure in rats byregulating the high mobility group B1(HMGB1)/Toll like receptor 4(TLR4)signaling pathway.Methods The ratmodel of chronic heart failure was established by subcutaneous injection of isoproterenol.The
7、 rats were groupedinto normal group,model group,low-dose lidocaine group,high-dose lidocaine group and EP(HMGB1 inhibitor)group.Ultrasound was applied to detect the cardiac function of rats in each group.ELISA was used to measure thelevels of serum atrial natriuretic peptide(ANP),brain natriuretic p
8、eptide(BNP),IL-1 and TNF-.HE stainingand Masson staining were applied to observe the histopathological changes of rat heart.RT-qPCR was applied todetect the expression of HMGB1 and TLR4 mRNA.Western blot was applied to detect the expression of HMGB1,TLR4,NF-B,p-NF-B,Bcl-2,and Bax related proteins.Re
9、sults HE staining showed normal morphology and广东药科大学学报第39卷structure of myocardial cells in the normal group,while the Masson staining showed dense and orderlyarrangement of myocardial tissue,with no collagen deposition between tissues.Compared with the normal group,the myocardial cells of the model
10、group rats were convoluted,irregularly arranged in morphology and structure,with more inflammatory cell infiltration,a large amount of collagen deposition between tissues,and a heavierdegree of myocardial fibrosis.Meantime,the levels of LVEDD and LVESD,the levels of ANP,BNP,IL-1 andTNF-,the levels o
11、f HMGB1 and TLR4 mRNA,the expression of HMGB1,TLR4,p-NF-B/NF-B,and Baxproteins in rats were obviously increased,but the levels of LVEF and LVFS,and the expression of Bcl-2 proteinwere obviously reduced in the model group(P0.05).Compared with the model group,the myocardial celldamage in the low-dose,
12、high-dose lidocaine groups,and EP group was obviously improved,the collagen proteinin myocardial tissue was clearly reduced,and the degree of myocardial fibrosis was obviously reduced.Meantime,the levels of LVEDD and LVESD,ANP,BNP,IL-1 and TNF-,the levels of HMGB1 and TLR4 mRNA,and theexpression of
13、HMGB1,TLR4,p-NF-B/NF-B,and Bax proteins were obviously reduced,while the levels ofLVEF and LVFS,and the expression of Bcl-2 protein were obviously increased(P0.05).Conclusion Lidocaine can inhibit the HMGB1/TLR4 signaling pathway,reduce inflammatory damage,and improve cardiac function in rats with c
14、hronic heart failure.Key words:lidocaine;HMGB1/TLR4 signaling pathway;chronic heart failure慢性心力衰竭指由于心脏损害后收缩和舒张功能障碍,导致心脏结构改变,供血功能降低,各类心血管疾病最后都会导致该结果,严重威胁人民生命健康安全1。随着人们生活方式的改变及老龄化人口的增加,心血管疾病的发病率呈逐年升高的趋势,同时也给社会带来严重的经济压力2。慢性心力衰竭过程中往往伴随着严重的炎症反应,因此,如何降低炎症反应成为治疗慢性心力衰竭的研究方向3。利多卡因是临床上常用的麻醉药物,随着对利多卡因的深入研究,发现其
15、在炎症反应中发挥重要作用4。张雯等5研究表明利多卡因通过抑制炎症反应可减少神经元凋亡,实现对脓毒症模型大鼠的大脑保护作用。刘庆文等6研究表明利多卡因可降低缺血再灌注大鼠炎症因子的释放,发挥对肾损伤的保护作用。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)与其受体Toll样受体4(TLR4)结合后,可激活其下游核转录因子(NF-B),从而产生大量炎症因子释放而对机体造成损伤7。李柏新等8研究表明克雷伯菌引发肺炎,激活HMGB1/TLR4/NF-B信号通路,促进炎症因子释放,蓝萼甲素通过抑制其信号通路可改善炎症损伤。冷晓雪等9研究表明牛蒡子苷元通过抑制 HMGB1/TLR4/NF-B 信号通路,可减轻炎症反应,
16、从而减少炎症引起的神经元凋亡。推测HMGB1/TLR4/NF-B信号通路在炎症反应中发挥关键作用。本研究就利多卡因调节HMGB1/TLR4信号通路对慢性心力衰竭大鼠的心脏保护作用进行研究,以期为临床用药提供实验参考。1 材料与方法1.1 实验材料、试剂和仪器选取180200 g的SPF级SD雄性大鼠60只,购于上海懿尚生物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(粤)2022-0011,自由进食饮水,环境条件(222),湿度(605)%,光照为 12 h 光-暗循环(AM7:00-PM7:00)。实验过程在川北医学院附属医院基础医学实验室进行,已通过川北医学院附属医院动物伦理委员会审核批准(伦理批
17、号:202204119)。利多卡因(6108-05-0)购自西南药业股份有限公司;异丙肾上腺素(HY-B0468/CS-2582)购自MedChemExpress 公司;HMGB1 信号通路抑制剂-丙酮酸乙酯(EP)(E47808)购自 Sigma 公司;Trizol试剂(15596-026)购自上海乔羽生物科技有限公司;蛋白提取试剂盒(XY-MY-1049)购自济凡生物科技有限公司;ANP、BNP、IL-1 和 TNF-(E-EL-R0017c、E-EL-R0126c、E-EL-R0012c、E-EL-R2856c)试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;NT-proBNP(FY-A01
18、4908)购自上海富雨生物科技有限公司;RT-PCR试剂盒(PR2552)购自广州威佳科技有限公司;总 RNA 提取试剂盒(K3101)购自上海奥陆生物科技有限公司;HMGB1、TLR4、NF-B、p-NF-B、Bcl-2、Bax一抗及二抗(ab18256、ab22048、ab141406、ab235502、ab14152、ab32503、ab150113)均购自英国Abcam公司;荧光定量PCR仪(Lepgen-96)26第4期冯昌盛,等.利多卡因调节HMGB1/TLR4信号通路对慢性心力衰竭大鼠的心脏保护作用购自南京贝登医疗股份有限公司;CX41显微镜购自上海笃玛生物科技有限公司;RM22
19、45病理切片机购自德国 Lecia公司;超声多普勒仪 A8200S2购自上海聚慕医疗器械有限公司;RZ-VEVO 3100超声心电图仪购自上海然哲仪器设备有限公司。1.2 造模与分组给药造模:采用异丙肾上腺素皮下注射制备慢性心力衰竭模型大鼠,皮下多点位注射剂量为5 mg/kg/d的盐酸异丙肾上腺素,连续注射7 d,继续喂养14 d,眼眶取血后ELISA法检测NT-proBNP、超声心电图检测心功能,确认慢性心力衰竭大鼠造模成功10。分组给药:将 60 只 SD 大鼠随机分为正常组、模型组、利多卡因低、高剂量组和EP组,每组12只,除正常组外其他组进行慢性心力衰竭造模。利多卡因(低、高)剂量组于
20、造模成功后分别腹腔注射 5、10 mg/(kgd)11的利多卡因,EP 组腹腔注射40 mg/(kgd)的EP12,正常组和模型组注射等量生理盐水,治疗14 d。1.3 超声检测大鼠心功能给药结束后,用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,采用超声多普勒检测大鼠心功能。根据心室波群的M型曲线测量大鼠左室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)数值,连续检测 3 个心动周期,取平均值,评价大鼠心脏功能。1.4 ELISA检测血清心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、IL-1和TNF-水平取大鼠主动脉血,离心收集上清,按照 ELISA试剂盒说
21、明书步骤检测 ANP、BNP、IL-1、TNF-水平。1.5 HE染色和Masson染色观察大鼠心脏组织病理学变化腹主动脉取血后,处死大鼠,于大鼠心尖处剪取适量心脏组织,清洗之后用 4%()多聚甲醛固定,乙醇脱水,石蜡包埋,切片。然后分别进行HE染色和Masson染色,观察心肌组织病理变化和心肌纤维化情况。1.6RT-qPCR检测 HMGB1 mRNA和 TLR4 mRNA表达取左心室组织低温研磨匀浆,提取总RNA,用逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA,然后对cDNA 进行荧光定量 PCR 扩增。以 GAPDH 为内参,使用 2-Ct方法计算 HMGB1 mRNA 和 TLR4mRNA
22、 的相对表达量。HMGB1 mRNA:正向:5-GGCGGCTGTTTTGTTGACAT-3;反向:5-ACCCAAAATGGGCAAAA GCA-3;TLR4 mRNA:正向:5-GGCTTCTAACCTCAACGACCT-3;反向:5-AGTATTCTTTGCCTGAGTTGCTT-3;GAPDH:正向:5-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3;反向:5-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3。1.7 Western blot检测相关蛋白的表达取左心室组织匀浆,提取总蛋白质,BCA检测组织中蛋白表达量,蛋白变性后进行电泳然后转膜,封闭液中封闭后加入HMGB1、TLR4、NF-
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