牛源鲍曼不动杆菌的分离鉴定及病原性分析.pdf
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1、1F百间川学吊诞(19/4一)另(社肤):业四降女八高级普庆川1502023 年 Vol.39(4)广西畜牧兽医调研查究牛源鲍曼不动杆菌的分离鉴定及病原性分析究李常挺,陶立,冯威巍?,梁靖,吴翠兰,彭昊1*,兰美益,李军1*,马春霞(1.广西壮族自治区兽医研究所斤广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁530 0 0 1;西都安大都华牛农业科技有限公司,广西都安530 7 0 0;3.钦州澳华进出口贸易有限公司,广西钦州5350 0 0)中图分类号:S858.235.1*2文献标识码:B文章编号:10 0 2-52 35(2 0 2 3)0 4-0 150-0 4doi:10.3969/j.iss
2、n.1002-5235.2023.04.002鲍曼不动杆菌,又称鲍氏不动杆菌,属于不动杆菌属,革兰氏阴性菌,广泛地存在于土壤和水等自然环境中,也存在于健康人的皮肤、咽、结膜、唾液、胃肠道及阴道分泌物中,是一种条件致病菌,可引起菌血症和肺炎、脑膜炎、腹膜炎、心内膜炎、泌尿道以及皮肤感染 1.2 。黄志坚、顾天召等 3.4 人于19 9 6 年和19 9 7 年对鱼暴发性死亡的病原进行了调查并分离出鲍曼不动杆菌,除水产动物外,国内也有报道大熊猫、仔猪、鸡、鸭和山羊等动物感染鲍曼不动杆菌发病死亡的案例 5-9 。为确定南宁市某牛场病死牛的病因和查找病原,从病死牛的肺细支气管中分离到1株疑似鲍曼不动杆
3、菌。该菌与牛源、人源鲍曼不动杆菌亲缘关系较近。经细菌分离、生化试验、致病性试验、药敏试验、16SrRNA基因鉴定和病理组织切片观察,证实该病牛感染鲍曼不动杆菌并确定有致病性。分离菌液浓度在410 CFU/mL时对小鼠的致死率为100%;分离菌仅对测定的恩诺沙星等4种药物高敏,对其他11药物耐药。本病例可为临床防治鲍曼不动杆菌提供参考。1材料1.1主要仪器设备和试剂Bio-RADT100 PCR 仪、Universal Hood I 凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司,SiGMA1-14离心机购自德国SiCMA公司,恒温培养箱购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司,生物显微镜购自日本尼康公司;血平
4、板购自郑州安图生物工程股份有限收稿日期:2 0 2 2-0 6-0 6基金项目:广西重点研发计划(AB21238003),桂科专项(18-3,19-3);南宁市重点研发计划(2 0 2 12 0 2 3);良庆区重点研发计划(202109)。硕士,研究方向为动物疫病防控与兽医微生物学,E-mail:。*通讯作者。E-mail:;E-m a i l:j l e e 9 9 8 。公司,营养肉汤购自北京陆桥技术责任有限公司,细菌基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司,细菌微量生化鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司,药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。1.2病料来源来自广西南宁市某牛场
5、病死牛的病变脏器;健康小鼠购自广西医科大学实验动物中心。2方法2.1细菌分离无菌从肺细支气管、肝脏、脾脏等组织划线接种血平板,培养2 4h后挑取优势菌落进行纯化培养,染色镜检,挑取纯化的单个菌落接种肉汤,37 扩大培养。2.2细菌16 SrRNA基因鉴定及进化分析取分离菌液离心,提取其DNA进行16 rRNA基因扩增,将PCR阳性产物克隆送至生物公司测序,测序结果用BLAST比对核苷酸序列,以MEGA软件构建系统发育进化树。2.3生化试验取纯化分离菌液,接种于细菌微量生化反应管中,37 培养2 4h48h,观察结果。2.4致病性试验将小鼠随机分为实验组和对照组,5只/组,实验组腹腔注射分离菌液
6、,菌液浓度为410 CFU/mL,0.5mL/只;对照组注射等量的灭菌生理盐水。实验过程中,若有小鼠死亡,剖检死亡小鼠并回收分离菌。2.5药敏试验采用K-B药敏纸片法测定分离菌对药物的敏感程度,将纯化分离菌液均匀涂布于血平板,盖上药敏纸片,37 培养2 4h后测量抑菌圈的直径大小。1512023年Vol.39(4)广西畜牧兽医2.6试验小鼠的病理组织切片观察解剖死亡小鼠、采集肺脏等新鲜组织,用10%福尔马林固定,按脱水、透明、石蜡包埋、HE染色等程序制作病理组织切片,光镜下观察组织病变情况。3结果和分析3.1细菌分离结果肺细支气管分离菌经纯化后在血平板上生长良好,形成中等大小,边缘整齐的菌落,
7、圆形,灰白色,光滑湿润;其他脏器未分离到细菌。分离菌为革兰氏染色阴性,球杆状,单个散在或成对排列。3.2PCR鉴定结果及遗传进化分析分离菌经16 SrRNA通用引物基因扩增,琼脂糖凝胶电泳结果显示在约140 0 bp处有一特异性条带(图1),经克隆片段进行测序,鉴定为鲍曼不动杆菌,将其命名为gxqingxiu01株;分离菌经BLAST比对核苷酸序列,使用MEGA软件绘制系统发育进化树分析结果表明,该菌与人源鲍曼不动杆菌(NCBI序列号:JN668402)、牛源鲍曼不动杆菌(NCBI序列号:JQ404488)亲缘关系较近,与昆虫源鲍曼不动杆菌(NCBI序列号:KX966428)遗传距离较远(图1
8、)。M1500bpgxqingxiu01.seqJN668402.1.seqKX242271.1.seqJF313146.1.SeqJN668838.1.seqJQ404488.1.seqEU883589.seqNR117620.1.SeqKT964444.1.seqEU733247.seqKX966428.1.seq7.8.6420NucleotideSubstitutions(x100)图1分离菌16 SrRNA系统发育进化树3.3生化试验结果生化试验显示,乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、密二糖试验呈阳性,果糖、MR-VP试验MR、M R-VP试验VR、西蒙氏枸橡酸盐、枸橡酸盐、乙酰
9、甲基甲醇、吲哚试验阴性,符合鲍曼不动杆菌生化特性(表1)。表1生化试验结果项目结果乳糖+葡萄糖+木糖+阿拉伯糖+果糖一麦芽糖+密二糖+MR-VP试验MR一MR-VP试验VR一枸橡酸盐一乙酰甲基甲醇一吲哚注:+:阳性;一:阴性3.4致病性试验结果对照组小鼠观察7 d未见异常;实验组小鼠48h全部死亡,死亡率10 0%。剖检死亡小鼠发现肺脏出血,肝脏、脾脏肿大等病变(图2);从死亡小鼠分离细菌进行染色镜检、生化试验和测序鉴定,结果显示与接种菌相同图2实验组小鼠解剖病变3.5药敏试验结果分离菌仅对测定的恩诺沙星等4种药物高度敏感,对头孢噻钠等5种药物中度敏感,对青霉素、氨苄西林钠等11种药物耐药(表
10、2)。3.6病理组织切片观察结果试验死亡小鼠的肺组织出现肺泡隔局部淋巴细胞增生,并伴随有多发性淋巴滤泡,滤泡多呈圆形或类圆形,主要由淋巴细胞组成,且生发中心较为明显;此外,还出现有支气管扩张,并有白细胞和单核细胞渗出等炎症反应。1522023年Vol.39(4)西畜牧兽医表2分离菌体外药敏试验结果抑菌圈结果药物抑菌圈结果药物名称直径/mm判断名称直径/mm判断青霉素0R强力霉素20S氨苄西林钠0R阿奇霉素8R头孢拉定钠0R复方新诺明0R头孢曲松钠8R诺氟沙星141头孢噻钠131环丙沙星20S链霉素10恩诺沙星24S卡那霉素111氧氟沙星22S大观霉素8R多粘菌素9R四环素141利福平0R罗红霉
11、素9R替米考星8R注:抑菌圈直径()10 mm为耐药(R),10 mm15mm为中介(I),15 mm为敏感(S)。4分析和讨论鲍曼不动杆菌作为一种条件致病菌,可在环境中长期存活,通过直接接触受污染的水、食物等传播,鲍曼不动杆菌感染牛引起发病和死亡,国内仅有重庆、山西、四川等有相关报道10-12 。本次试验从广西本地死亡病牛脏器中分离到的鲍曼不动杆菌,核苷酸同源性比较和系统发育进化分析结果显示,分离菌和人源鲍曼不动杆菌菌株亲缘关系较近,属于同一进化分支;小鼠的致病性试验表明该菌致病性较强,提示着该菌或有可能成为人畜共患传染病的未来潜在威胁。当前细菌耐药性和超级细菌已经成为人类共同面临的严峻的公
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