生物3D打印技术及水凝胶生...墨水在医用材料中的应用分析_史杰中.pdf
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1、50 引言生物 3D 打印1将细胞、生物材料和生长因子混合,共同打印成所设计的结构,因此也被称为活细胞 3D 打印。该技术可以精确控制 3D 微观结构和细胞的空间分布,可用于构建具有复杂微结构和生理功能的体外仿生组织和器官,近年来被广泛应用于组织器官的修复再生2。其中,细胞、生物材料和生长因子的混合物被称为生物墨水,其核心是生物材料。生物材料通过为细胞提供机械支撑并调节其生理活动而发挥细胞外基质(ECM)的作用3,需要综合考虑打印条件和组织结构的功能要求。理想的生物材料应具有优异的打印性、力学性能、生物相容性和降解性,且在打印过程中保证细胞不受损害4。水凝胶5由于与细胞外基质相似的含水量和拓扑
2、结构,被广泛地应用于细胞培养、组织工程和再生医学等方面的研究,是理想的生物3D打印材料6。化学交联的高分子水凝胶是最早、也是最广泛研究的水凝胶体系,由于其力学强度高、稳定性好及制备成本低,已经成为广泛应用的组织工程材料。然而,共价交联的稳定结构不易直接打印,同时也限制了内部细胞增殖和迁移。此外,化学交联反应本身以及产物较难降解的性质也限制了其在生物医学中的应用。因此,人们进一步发展了依赖于超分子相互作用的物理水凝胶,其良好的刺激响应性、触变性和自愈合性为水凝胶的打印及细胞的迁移提供了条件。但是由于高分子链长度的分散性、交联点产生的随机性及高分子链在溶液中的构象不确定性等原因,物理水凝胶的分子通
3、透性与 ECM 仍有差距,从而限制了细胞在网络中的正常生长和代谢。同时,随着细胞的增殖和迁移,其体积的增加会造成周围环境压力的增加,对细胞产生损害。文章着眼于生物 3D 打印技术,介绍了目前常用的几种生物3D打印方法,并总结了当前常用的水凝胶材料,包括天然水凝胶材料和合成水凝胶材料,最后对生物 3D 打印技术及其用水凝胶材料存在的挑战和未来的前景进行了论述。1 生物 3D 打印方法生物 3D 打印技术可以在计算机的辅助下,将封装在生物材料中的细胞准确沉积到特定的位置,从而形成复杂的三维结构。目前主要的生物 3D 打印方法有三种(见图 1),分别是挤出式生物打印、喷墨式生物打印和激光辅助生物打印
4、。细胞类型、生物材料性质、打印分辨率以及应用的不同都会影响打印方法的选择,要根据实际情况选择相应的打印方法。1.1 挤出式生物打印挤出式生物打印是目前使用最广泛的一种生物打印方法7,其工作原理生物 3D 打印技术及水凝胶生物墨水在医用材料中的应用分析 摘要:生物3D打印是将细胞、生物材料和生长因子等组分共同混合打印成设计结构的技术,因其精确控制细胞空间分布的能力,近年来被广泛应用于组织器官的再生修复。水凝胶具有与细胞外基质相似的含水量和拓扑结构,因此在生物 3D 打印领域具有广阔应用前景。文章综述了目前常见的生物 3D 打印方法,介绍了重要的水凝胶材料,同时对生物 3D 打印技术及水凝胶生物墨
5、水存在的挑战和未来的前景进行了论述。关键词:生物 3D 打印;水凝胶;生物墨水;活细胞打印中图分类号:R318.08;TQ427.2 文献标志码:A 文章编号:1003-1308(2023)5-0050-06史杰中 (中国石化医用卫生材料研究与应用重点实验室,中国石化北京化工研究院,北京 100013)51更快的打印速度。但是在打印过程中液体会存在溅射的情况,因而影响了其打印分辨率。1.3 激光辅助生物打印激光辅助生物打印是基于激光诱导向前转移(LIFT)原理13的一种打印技术,最初是用于金属的沉积,目前已成功应用于生物医学领域,用于沉积DNA、细胞和生物材料等14。激光辅助生物打印机由靶板、
6、激光源和接收基底三部分组成。如图 1-c 所示,其中靶板是三层结构,分别为透明玻璃层、金属吸收层和生物墨水层。当激光打到靶板的特定位置时,该位置的金属吸收层被激光脉冲激发,从而使被激光照到部分的生物墨水滴下,沉积到接收基底上。相较于上述两种生物3D打印方法,激光辅助生物打印技术无需喷头,有效避免了生物材料和细胞的堵塞问题,可打印高黏度的生物墨水,其细胞密度可以达到 108 个/毫升15。同时,该方法在打印过程中没有剪切力和压力的产生,对细胞的损害极小,可以打印任何类型的细胞。更重要的是,由于单束激光具有极高的分辨率,该打印方法可以实现纳米级别的打印,并且可以控制每个液滴只包含一个细胞,其分辨率
7、远高于挤出式和喷墨式生物打印,但是该方法中影响打印分辨率的因素很多,如接收基底表面亲水性、靶板和接收基底的间隙、生物墨水的厚度和黏度等,因此在实际使用过程中,需要对这些因素进行精确调控。此外,由于金属吸收层的存在,最终打印结构中会存在金属残留物,现在的工艺可以使用非金属吸收层甚至不需要吸收层16,使得该方法的生物相容性得到进一步提升。2 生物 3D 打印用天然水凝胶材料目前,多种水凝胶都已被用于生物 3D 打印制造组织器官模型,按照来源的不同,这些水凝胶可以被分为两大类:天然水凝胶材料和合成水凝胶材料。天然水凝胶通常来源丰富、成本较低,具有优异的生物相容性和可降解性,能够有效促进细胞生长、黏附
8、和迁移,但是打印性和力学强度较差,免疫原性较强,导致打印的细胞存活率不高。常用的天然水凝胶包括海藻酸纳、胶原蛋白、明胶、琼脂糖、纤维蛋白和透明质酸等。2.1 海藻酸钠海藻酸纳是一种源于海藻细胞壁的天然多糖,是 3D 生物打印中最常用的天然材料17。通常情况下,海藻酸钠会在多价阳离子,如 Ca2+、Ba2+的存在下发生交联,进而形成水凝胶。其力学性能取决于聚合物的浓度和分子量,以及阳离子种类和浓度。Shu 等使用双喷头打印机成功打印了封装细胞的海藻酸钠水凝胶18。如图2-a 所示,双喷头打印机的左侧喷头是封装了人胚胎干细胞(hESCs)的海藻与传统的熔融沉积制造(FDM)非常类似。FDM 是材料
9、熔融后通过喷头挤出,冷却固化后形成所设计的形状。材料通过螺旋进料器持续输送,因此打印的模型具有连续的结构8。挤出式生物打印是一种压力驱动的打印方法,如图 1-a所示,通过压力将生物墨水从喷头中挤出,从而打印出连续的三维结构9。压力的产生有机械驱动和气体驱动两种方式,机械驱动可以更精准地控制液体的挤出,而气体驱动通常会有延迟,对于不同的材料,每次都要预先建立气压与挤出速度的关系图。挤出式生物打印的优势在于操作简单,成本较低,可以通过控制喷头直径调控打印分辨率,实现微米级的打印。但是这种打印方式需要生物墨水具有适当的黏度,黏度过低无法连续地打印出来,黏度过高容易堵塞喷头10。同时,细胞存活率会受到
10、气压和喷头直径的影响。降低气压,增大喷头直径虽然可以有效提高细胞存活率,但是也会牺牲分辨率和打印速度。1.2 喷墨式生物打印喷墨打印是一种非接触式打印技术,发明于 20 世纪 70 年代,可将微量的液滴打印到精确位置11。常见的喷墨方式有热喷墨和压电喷墨两种(图1-b)。热喷墨是通过电加热使生物墨水汽化,然后利用汽化膨胀产生的压力将墨水以液滴的形式喷出,这种方式涉及高温,会对细胞有损害,且很难控制液滴尺寸和喷射方向;压电喷墨是通过电流信号控制压电元件发生形变,进而产生压力使墨水喷出,该方式能够精准控制喷射方向和液滴尺寸,且全程不需要加热,因此更适用于生物打印体系12。利用喷墨式生物打印,细胞的
11、空间排列可以被精确控制。相较于挤出式生物打印,喷墨式生物打印可以打印流体材料,对材料的兼容性更高,且具有图1 常用的生物 3D 打印方法(a)挤出式生物打印 (b)喷墨式生物打印 (c)激光辅助生物打印52 酸钠溶液,右侧喷头是氯化钙水溶液。海藻酸钠液滴阵列首先从左侧喷头中打出,之后再利用右侧喷头在液滴上打印一层氯化钙水溶液,海藻酸钠和氯化钙就会在几秒钟内形成连续的水凝胶。通过交替逐层打印,最终就可以得到预先设计的三维结构。最后将打印的结构放置于氯化钡水溶液中,使打印结构进一步交联,提高其稳定性。实验表明打印的细胞具有较高的活性(图2-b),将其置于分化培养基中,可以在水凝胶中最终分化成类似肝
12、细胞。为了打印更加复杂的结构,Shu 等又发明了一种新型的打印方式19,如图 2-c所示,首先封装细胞的海藻酸钠水溶液预先用钙离子交联,并装在打印机中,通过挤出方式打印在多孔膜平台上。多孔膜平台可以沿着z轴上下移动,下方是氯化钙水溶液,在打印过程中,多孔膜平台缓慢向下移动,因此已经打印的结构就可以浸没在氯化钙水溶液中,进行二次交联,给未打印的结构提供更好的支撑。最后,打印的结构再浸入氯化钡溶液中进行三次交联,以增加其稳定性。利用这种方法可以打印出复杂的血管结构(图 2-d),且细胞具有较高的存活率。海藻酸纳水凝胶具有低成本、低免疫性、低毒性等优势,可以在室温下快速形成稳定的、可降解的水凝胶,具
13、有较高的打印分辨率,在生物医学领域有广泛的应用前景20。但是其生物惰性导致细胞粘附性较差,不利于细胞的增殖和分化,一般情况下可通过修饰RGD(天冬酰胺-甘氨酸-天冬氨酸)基团增强细胞黏附性,且水凝胶的形成需要钙离子的参与,限制了其在体内的应用。2.2 胶原蛋白胶原蛋白是人体中最丰富的结构蛋白,主要位于结缔组织的细胞外基质中。胶原蛋白的类型有很多,最常用的是 I 型胶原蛋白,它是一种具有三螺旋结构的多肽21。胶原蛋白是一种可生物降解的蛋白质,生物毒性较低,其中的 RGD 序列可以有效促进细胞的黏附和迁移。但是胶原蛋白的成胶时间较长,在 37下要半小时才能成胶,且成胶后机械性能较差,不利于打印结构
14、的稳定。同时,胶原蛋白在低温下是液体状态,提高温度或把溶液 pH 调为中性才能形成纤维结构,增加了操作的复杂性。Feinberg 等利用 FRESH(freeform reversible embedding of suspended hydrogels)打印方法成功打印了不同尺寸的人体心脏部件22,如图 3-a 所示,他们将封装人类干细胞衍生心肌细胞的胶原生物墨水直接打印到明胶支撑材料中,明胶在打印过程中可以提供支撑作用,打印后再将明胶去除,就可以得到左心室生物模型。打印的左心室具有部分生理功能,可以观察到波传播行为。2.3 明胶明胶是由动物结缔组织中的胶原部分降解而成的材料,其机械性能很高
15、,性质稳定,是一种优异的支撑材料。但是明胶的力学强度随温度变化过于敏感,在 37是液体状态,限制了其作为组织工程材料的应用,通常需要通过化学交联或酶交联使其进一步稳定。醛类经常被用于连接明胶赖氨酸上的-氨基23,碳二亚胺也被用于活化羧酸基团并加速其与氨基缩合形成酰胺键24。化学交联法的试剂通常都具有一定毒性,相比而言,酶交联法具有更好的生物相容性。转 谷 氨 酰 胺 酶(Tgase)可 通 过谷氨酰胺的-羰基和赖氨酸残基的-氨基的酯化使聚合物交联25。Venkatraman 等成功地将含有 Tgase 的明胶生物墨水打印成 3D 结构,如图3-b 所示,封装在明胶中的人胚胎肾细胞 293(HE
16、K293)和人脐静脉内皮细胞(a)双喷头生物 3D 打印海藻酸钠水凝胶示意图 (c)新型生物 3D 打印方式制造复杂海藻酸钠水凝胶结构示意图 (d)打印的血管结构(a)FRESH 打印法制备胶原蛋白水凝胶左心室生物模型(b)生物 3D 打印包含 HEK293 细胞的明胶水凝胶(b)hESCs 在不同压力和喷头直径下打印后的存活率图 3 生物 3D 打印胶原蛋白水凝胶和明胶水凝胶图 2 生物 3D 打印海藻酸钠水凝胶 53(HUVEC)可以自由生长和分化,在体外培养后会生成类似血管的结构26。3 生物 3D 打印用合成水凝胶材料合成水凝胶通常具有优异的机械性能,但是生物相容性和可降解性较差27。
17、常用的合成水凝胶包括普朗尼克F127、人工合成聚多肽、修饰过的聚乙二醇、聚己内酯和 DNA 等。3.1 普朗尼克 F127普朗尼克 F127 是一种三嵌段共聚物,由两段聚乙二醇和一段聚丙二醇构成,是 3D 生物打印中最常用的人工合成材料28。普朗尼克 F127 具有优异的机械强度和剪切变稀性能,一般通过挤出式生物打印进行打印,分辨率很高,常用于精细结构的打印;普朗尼克F127 还具有温度响应性,室温下可以迅速成胶,低温条件下又可以很快转变为溶液状态,故而常被用作牺牲材料形成血管结构29。但是普朗尼克 F127 的生物相容性较差,无法用于细胞的长时间培养。Zenobi 等提出了一种纳米结构改性方
18、法,以提高普朗尼克 F127 水凝胶在可打印浓度下的生物相容性30。如图4-a所示,他们将丙烯酸酯改性的普朗尼克F127 与纯普朗尼克 F127 掺杂,与软骨细胞混合后通过 3D 生物打印制备出所设计的结构,并利用紫外辐射将改性的普朗尼克 F127 交联,之后从交联网络中将纯普朗尼克 F127 洗脱,就得到了纳米结构改性的普朗尼克F127水凝胶。利用该方法,软骨细胞在水凝胶中的存活率由 62%提高至 86%(图 4-b),且封装细胞的水凝胶也表现出良好的打印性能。3.2 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)是一种很常见的聚合物材料,其结构明确,合成容易,经过修饰的 PEG 可以通过挤出式或激光辅助方法进
19、行生物打印31。光聚合是制备 PEG 水凝胶最常用的方法,聚乙二醇丙烯酸酯经常被用到光聚合中,包括聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGMA)和多臂聚乙二醇丙烯酸酯(n-PEG-Acr)等。Cui 等 将 丙 烯 酸 改 性 的 多 肽、PEGDA 与人间充质干细胞(hMSCs)混合组成生物墨水,通过喷墨式生物打印制备出多孔支架32。如图 4-c 所示,在打印过程中同时利用紫外光进行聚合,就可以保证细胞固定在打印的位置。该研究证明了 PEG 水凝胶具有良好的生物相容性,打印结构中的细胞存活率可达到 87.9%(图 4-d),由于 PEG 聚合物的黏度较低,打印过程不会
20、出现喷头堵塞的情况。3.3 DNA传统高分子水凝胶与细胞外基质最大的区别是通透性,由于高分子链长的分散性,水凝胶网络交联点之间的距离一般服从正态分布,从而导致水凝胶的网孔大小也服从正态分布。小孔的存在使得水凝胶的分子通透性变差,营养物质、蛋白等大分子无法有效进入水凝胶网络内部,抑制了其细胞培养和组织修复的效果。2009 年,Liu 等基于 DNA 自组装设计提出了一种纯 DNA 超分子水凝胶的制备策略33。如图 5-a 所示,此水凝胶的基本单元是由三条短链 DNA 组装成的 Y 型组装体,组装体末端带有半个i-motif 结构,在酸性环境中,i-motif 四链结构作为连接子将 Y 型结构交联
21、在一起形成水凝胶,碱性条件下又转化为溶液状态。此凝胶网络由全刚性的 DNA双链和四链结构构成,不能塌缩,造成了在孔径分布中一定尺寸之下的小孔不存在,这样的网络结构使得分子可以比较容易地在网络中扩散,具有良好的分子通透性。之后,Liu 等又对此策略进行了拓展,将 Y 型结构间的连接子设计(a)生物 3D 打印纳米结构改性的普朗尼克 F127 水凝胶(a)生物 3D 打印纳米结构改性的普朗尼克 F127 水凝胶(c)在光聚合的同时生物 3D 打印PEGDA 水凝胶(b)打印的结构和封装的牛软骨细胞活死染色图片(d)打印结构中的人间充质干细胞(c)在光聚合的同时生物 3D 打印 PEGDA水凝胶(b
22、)打印的结构和封装的牛软骨细胞活死染色图片(d)打印结构中的人间充质干细胞图 5 生物 3D 打印 DNA 水凝胶图 4 生物 3D 打印普朗尼克 F127 水凝胶和聚乙二醇水凝胶54 为带有粘性末端的双链 DNA,制备了生理条件下稳定的 DNA 超分子水凝胶(见图 5-b)34。此凝胶形成速度非常快,两组分混合后在秒级水平便可成胶。利用此凝胶快速形成、高通透性和双重响应性等特点,可实现单细胞的封存、培养与可控释放35。为了拓展 DNA 超分子水凝胶的应用,Liu 等将葫芦脲 8(CB8)和 DNA 相结合,制备了一种完全基于物理交联的超分子双网络水凝胶36。如图 5-c 所示,该双网络水凝胶
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