双峰驼TLR3蛋白的表达与抗体制备及在肾脏的分布_张睿.pdf
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1、动物医学进展,():双峰驼 蛋白的表达与抗体制备及在肾脏的分布收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目(,)作者简介:张睿(),女,甘肃环县人,硕士研究生,主要从事兽医病理学与动物黏膜免疫学研究。通讯作者张睿,李沛轩,刘转霞,刘静宇,房映栋,刘柯江,张旺东,王雯慧(甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 )摘要:为制备双峰驼 样受体()的抗体,分析其在肾脏中的表达特征。用生物信息学分析及原核表达方式,分析、表达和纯化了双峰驼 重组蛋白,并制备多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附试验和免疫印迹法测定抗体效价及其特异性,利用制备的多克隆抗体采用免疫组织化学染色观察 在双峰驼肾脏组织中的表达。结果显示,得到的目
2、的蛋白大小与预测结果相符,为 ,最佳诱导浓度为 ,最佳诱导时间为,重组蛋白主要以包涵体形式表达,抗体效价达 ;免疫印迹结果显示,原核表达的 蛋白和双峰驼肾脏组织中表达的 蛋白均能被该抗体特异性识别,在双峰驼肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞均有表达。研究结果为进一步探究双峰驼 在肾脏中发挥作用的机制积累了资料。关键词:双峰驼;样受体;原核表达;抗体制备;肾脏中图分类号:;文献标识码:文章编号:()年 样蛋白在果蝇中被首次发现,该蛋白除与果蝇胚胎发育有关外,也能识别入侵的微生物,并发现其与天然免疫间存在着某些联系。随后在哺乳动物中发现该蛋白的同源体,即 样受体(,)。现在已知,是型跨膜蛋白,在非特异
3、性免疫中发挥核心作用,在特异性免疫中有重要作用,年人类 家族的发现可谓是免疫学领域的重大突破。迄今为止,家族个亚家族中已发现的成员至少有 个。根据 在细胞的定位被分为两类:一类包括 、,在细胞膜表面表达,可识别 细 菌、病 毒 等 表 面 结 构 成 分;另 一 类 包 括 、,在细胞内表达,主要识别来自细菌和病毒的核酸。作为一种重要的模式识别受体,在天然免疫中发挥重要作用。现已证实,在心、肝、脾、肺和肾等器官广泛表达。不同物种的 在结构上基本相似但略有差异,如人的 由 个氨基酸构成,而小鼠 由 个氨基酸构成;此外,同其他 相比,没有保守脯氨酸残基,而含有个重要的酪氨酸残基,它的基因由个外显子
4、组成,结构蛋白由外显子、编码,而其他 仅由个外显子所编码。研究表明,具有多重生物学功能,其与 、相似,均 以 核 酸 为 配 体,可 识 别 双 链 (),在宿主抗病毒反应中起到关键作用;同时,也能启动抗炎信号通路,参与炎症的调控。另外,还与一些肿瘤性疾病的发生有关。双峰驼是我国西北特色畜种,在发展民族文化、体育竞技和特色旅游等方面发展潜力巨大,本团队一直以双峰驼黏膜免疫相关研究为主。有研究显示,与多种肾病的发生与发展密切相关,但目前关于 与双峰驼肾病关系的研究很少。本研究选用双峰驼肾脏作为 的定位器官,利用生物 信 息 学 软 件 和 原 核 表 达 系 统,对 双 峰 驼 的基因特性进行分
5、析,表达重组蛋白,并制备兔抗双峰驼 抗体,通过免疫组织化学法观察 在双峰驼肾脏组织的表达,为进一步深入研究 在双峰驼尿生殖道黏膜免疫中的抗炎症、抗病毒及参与炎症调控的调节机理奠定基础。材料与方法材料主要试剂蛋白 ,生物科技有限公司产品;标记的山羊抗兔 ,生物医药有限公司产品;标签蛋白纯化试剂盒,上海尚宝生物科技有限公司产品;免疫组化DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.014试剂盒,生物工程有限公司产品。主要仪器切片机,德国 公司产品;正置显微镜带成像系统,日本 公司产品。实验动物日本大耳兔,雌性,体重约,购自兰州兽医研究所实验动物中心。方法 重组质粒的构建参照
6、中双峰驼 基因序 列(),选取编 码区,用 进行蛋白亲水性和抗原表位分析,用 和 进行跨膜区和信号肽分析后,截除跨膜区和信号肽,截取膜外区抗原指数较高的一段序列(区段:,预测分子质量 ),在碱基序列两端分别添加起始密码子 和终止密码子,接着,用 进行酶切位点预测,在该序列的上、下游分别添加酶切位点 和 ;经碱基优化后送金唯智生物科技有限公司合成,将测序合适的基因序列连接到 载体上,最终将获得的重组质粒 进行双酶切验证,将酶切验证后的 重组质粒冻干粉用 水稀释后转化进 ()感受态细胞,提取质粒送测,将测 序 正 确 的 阳 性 重 组 质 粒 命 名 为 。重组 的诱导表达及表达形式鉴定将 重组
7、质粒转化至感受态细胞 ()中,重 组 菌 命 名 为 (),挑取单个菌落接种()中过夜培养,取 过夜培养菌液加入到 ()中 培养至 值达到时,在无菌条件下取出制样作为诱导前对照,剩余部分加入 的 诱导后收集菌体,检测。为了确定目的蛋白的表达形式,溶菌酶破碎菌体并离心,分别取上清和沉淀制样,进行 检测。重组蛋白表达条件优化对 重组蛋白的表达条件进行优化。浓度设置 、,诱导时间设置、,然后进行 检测。重组 蛋白的纯化在最佳表达条件下,诱导表达 重组蛋白,溶菌酶破碎菌体,依据标签蛋白纯化试剂盒的说明对蛋白进行纯化,检测,紫外分光光度仪测定蛋白含量。动物免疫及多克隆抗体制备日本大耳兔适应性饲喂周后,将
8、纯化蛋白和弗氏完全佐剂等比例混合乳化,腘淋巴结和背部皮下分点注射免疫接种家兔,蛋白剂量为 只,周后将弗氏不完全佐剂和纯化蛋白等比例混合并乳化,以 只的剂量免疫。每隔周免疫接种次,次免疫后,心脏采血,分离血清保存备用。抗体效价检测以纯化后的蛋白为抗原,过夜包被酶标板(孔),洗涤,脱脂奶粉封 闭 后 再 次 洗 涤,加 入 梯 度 稀 释 的 兔 血 清,孵育,洗涤后加 标记的山羊抗兔 二抗(稀释),孵育,洗涤后加 显色液,暗室显色 后加入 的(孔)停止反应,用酶标仪测 值。重组蛋白的 鉴定将纯化的 重组蛋白制样,经常规电泳后,湿转转印至 膜,用含 脱脂奶粉的 封闭,洗膜,加兔血清一抗(稀释)孵育
9、过夜;经 洗膜次,加 标记的山羊抗兔 二抗(稀释)孵育后,用 洗膜次,最后用 发光液显色。免疫组织化学法检测 在双峰驼肾脏组织中的表达将本实验室制好的双峰驼肾组织石蜡切片按照免疫组化试剂盒中的操作步骤进行染色,一抗为免疫兔血清(稀释),二抗为山羊抗兔 (稀释),拍照观察。结果 重组质粒的构建预测分析双峰驼 蛋白亲水性(图)和抗原表位(图)后发现该蛋白为抗原指数较高的亲水蛋白;预测其跨膜结构后发现该蛋白共有 个氨基酸,其中氨基酸 组成其膜外区(图),预测信号肽后发现该蛋白无信号肽(图),用 ()截取膜外区抗原指数较高的一段序列(区段:,预测分子质量 ),在序列 两 端 添 加 起 始 密 码 子
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