广泛耐药铜绿假单胞菌肺炎大鼠模型的制备.pdf
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1、海南医学院学报 2023,29(15)Journal of Hainan Medical University广泛耐药铜绿假单胞菌肺炎大鼠模型的制备安然1,2,3,刘奉云1,2,赵启亮1,2,蔡文欣1,2,3,孙宏源1,2,陈明虎1,2,常力1,2,尹延重1,2,刘凯1,2,张慧琪1,2,刘旻1,2(1.天津中医药大学第一附属医院感染疾病科,天津 300193;2.国家中医针灸临床医学研究中心,天津 300193;3.天津中医药大学,天津 301617)摘要 目的:构建广泛耐药铜绿假单胞菌(XDRPA)感染大鼠肺炎模型。方法:雄性 SD 大鼠 24只随机分为空白组、低菌量组、中菌量组、高菌量组
2、。空白组经气管滴注 0.1毫升无菌生理盐水,低、中、高菌量组分别滴注 0.1毫升的菌悬液(菌浓度依次为 7.5109、31010、61010 CFU/mL)。造模后观察各组大鼠的精神状态、毛发、呼吸、活动、进食、体重等一般情况并绘制生存曲线;观察肺组织病理学特征及炎细胞浸润表现;通过肺组织匀浆细菌培养法对各组进行病原学鉴定。结果:空白组一般状态均正常,其他各组大鼠造模后出现精神萎靡,竖毛,呼吸急促,甚至口鼻出血,进食及活动减少,体重明显减轻,48 h内有不同程度的死亡,差异有统计学意义(P0.05)。病理学结果显示,空白组大鼠肺泡结构完整,肺泡腔清晰无渗出;低、中菌量组肺组织均出现明显炎细胞浸
3、润,肺泡结构破坏,肺泡间隔增厚,间质水肿,但中菌量组病理损伤更重,死亡率高达 50%,低菌量组死亡率 17%;高菌量组肺泡腔内可见红细胞、炎细胞及大量纤维素样渗出,有急性呼吸衰竭的病理学特征,死亡率高达 67%。肺组织匀浆细菌培养结果显示空白组无菌落生长;低、中、高菌量组均可见 PA 菌落生长。结论:气管内滴注低菌量(0.1 mL 7.5109 CFU/mL)XDRPA 菌悬液,可成功构建 XDRPA感染大鼠肺炎模型。关键词 广泛耐药铜绿假单胞菌;肺炎;动物模型;大鼠中图分类号 R563.1;R332 文献标识码 A 文章编号 1007-1237(2023)15-1128-07Establis
4、hment of extensively drugresistant Pseudomonas aeruginosa pneumonia model in ratAN Ran1,2,3,LIU Fengyun1,2,ZHAO Qiliang1,2,CAI Wenxin1,2,3,SUN Hongyuan1,2,CHEN Minghu1,2,CHANG Li1,2,YIN Yanzhong1,2,LIU Kai1,2,ZHANG Huiqi1,2,LIU Min1,2(1.Department of Infectious Diseases,First Teaching Hospital of Ti
5、anjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion,Tianjin 300193,China;3.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 301617,China)Foundation Project:This study was supported by Sci
6、ence and Technology Projects in Key Fields of Traditional Chinese Medicine in Tianjin(2021010);Discipline Development Fund of First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine(XKJJ201734)Author:AN Ran,Email:.Correspondence to:ZHANG Huiqi,Associate Chief Physician,Masteral
7、 Supervisor,M.M.,Email:;LIU Min,Chief Physician,Doctoral Supervisor,M.D.,Email:.Received:20230213 Revised:20230602 JHMU,2023;29(15):11281134DOI:10.13210/ki.jhmu.20230607.001网络出版地址:https:/ 天津市中医药重点领域科技项目(2021010);天津中医药大学第一附属医院学科发展基金(XKJJ201734)作者简介 安然,Email:。通讯作者 张慧琪,副主任医师,硕士研究生导师,医学硕士,Email:;共同通讯作者:
8、刘旻,主任医师,博士研究生导师,医学博士,Email:。收稿日期 20230213 修回日期 20230602 网络出版时间:20230608 14:44:311128安然等.广泛耐药铜绿假单胞菌肺炎大鼠模型的制备View from specialist:It is creative,and of certain scientific and educational value.ABSTRACT Objective:To establish extensively drugresistant Pseudomonas aeruginosa(XDRPA)infectioninduced pneum
9、onia model in rats.Methods:Twentyfour male SD rats were randomly divided into the blank group,the low bacterial group,the medium bacterial group,and the high bacterial group.The low,medium and high bacterial groups were given intratracheal instillation of 0.1 mL of bacterial suspension(bacterial con
10、centration in turn is 7.5109、31010、61010 CFU/mL),while the blank group were given the same volume of sterile normal saline.After modeling,the general conditions of rats in each group were observed,including mental state,hair,respiration,activity,eating,weight,and the survival curve was drawn.The pat
11、hological characteristics of lung tissue and the infiltration of inflammatory cells were observed.Pathogenic identification of each group was carried out by bacterial culture of lung tissue homogenate.Results:The general state of the blank group was normal,and the rats in other groups showed signs o
12、f mental depression,bristling,shortness of breath,even oral and nasal bleeding,decreased food intake and activity,and significant weight loss,and different degrees of death within 48 hours,the difference was statistically significant(P0.05).Pathological results showed that the alveolar structure of
13、rats in the blank group was complete,and the alveolar space was clear without exudation.The lung tissue of the low and medium bacterial groups showed obvious inflammatory cell infiltration,alveolar structure destruction,alveolar septum thickening,interstitial edema,but the pathological damage of the
14、 medium group was more severe,with a mortality rate of up to 50%,and the mortality rate of the low bacterial group was 17%.In the high bacterial group,red blood cells,inflammatory cells and a large amount of fibrinlike exudation can be seen in the alveolar space,which has the pathological characteri
15、stics of acute respiratory failure,and the mortality rate is as high as 67%.The results of bacterial culture of lung tissue homogenate showed that the blank group had no bacterial colonies,while PA colony growth can be seen in low,medium and high bacterial groups.Conclusion:Intratracheal instillatio
16、n of low bacterial count(0.1 mL of 7.5109 CFU/mL)XDRPA bacterial suspension can successfully construct a rat pneumonia model of XDRPA infection.KEYWORDS Extensively drugresistant Pseudomonas aeruginosa;Pneumonia;Animal model;Rat铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa,PA)是医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎的常见致病菌1,2
17、。PA 具有易定植、易变异、多耐药的特点,其耐药机制复杂3,容易产生超级细菌,造成难以治疗的感染。有研究表明耐药 PA 感染比不耐药 PA 感染患者死亡风险增加 24%,多重耐药 PA 感染者比敏感 PA 感染者住院死亡风险增加 2倍以上4。广泛耐药 PA(Extensively drugresistant PA,XDRPA)是临床常见的 PA 耐药类型,其导致的肺炎病情重、病程长、病死率高,抗生素选择严重受限,为临床治疗带来极大困难,加重了社会经济负担。构建 XDRPA 肺炎动物模型是研究其耐药机制、测试新型抗生素临床疗效的重要环节。本研究拟在前期预实验基础上,进一步比较不同菌量(低、中、高
18、)所致肺炎大鼠肺部病理学特征,最后确立最佳的 XDRPA肺炎模型。1 材料与方法 1.1材料1.1.1 实 验 动 物 雄 性 SPF 级 SD 大 鼠,体 重(16010)g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)20190008。所有动物适应性饲养 5 d,饲养条件:室内温度(241)、相对湿度 55%10%和 12 h明暗循环。1.1.2 主 要 试 剂 与 仪 器 XDR PA 菌 株(210608091)来源于临床痰液标本,由天津中医药大学第一附属医院检验科微生物实验室分离、纯化,使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(Vitek MS 系统,bioMrieux
19、)鉴定该菌株为铜绿假单胞菌,利用 viteck2compact(bioMrieux)全自动细菌鉴定药敏分析仪进行药敏测定。将菌株送往北京美优安诺生物科技有限公司进行测序分析,经16SrDNA 分子生物学鉴定为铜绿假单胞菌,与铜绿假 单 胞 菌(Pseudomonas aeruginosa strain)JCM 5962 MK796437.1 同源性为 100%。哥伦比亚血平板(广东环凯微生物科技有限公司,批号:M2357Y),伊红染液(北京中杉金桥生物科技有限公司,批号:ZLI9613),苏木素染液(北京中杉金桥生物科技有限公司,批号:ZLI9610),酸性乙醇分化液(源叶生物,批号:R207
20、77)。比浊仪(梅里埃 DensiCHEK Plus),恒温箱(上海一恒,型号:DHP9121B),双功能气浴恒温振荡器(常州金坛旭日实验仪器厂,型号:ZD85),离心机(北京北利,型号:DT53),脱水机(徕卡仪器有限公司,型号:LEiCA TP 1020),病理切片机(徕卡仪器有限公司,型号:LEiCA HistoCore MULTICUT),包埋机(金华市华速科技有限公司,型号:ES5001),冻台(金华市华速科技有限公司,ES5002C),组织摊片机(金华市华速科技有限公司,型号:ES5001129海南医学院学报 Vol.29 No.15 Aug.20233H),烤箱(上海一恒仪器有限
21、公司,型号:BPG9106A),显 微 镜(OLYMPUS,型 号:OLYMPUS CKX43LP),组织研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限 公 司,型 号:KZ F),全 景 扫 片 仪(3DHIS TECH)。1.2方法1.2.1菌悬液制备从80 冰箱中取出 XDRPA 菌株常温解冻,用一次性无菌接种环转种于血平板,分区划线以分离单菌落,倒置于恒温箱孵育培养,37,1824 h,可见圆形、扁平湿润、边缘不规则、有特殊生姜味的灰绿色菌落,周围有透明溶血环,染色镜检为革兰阴性杆菌。挑选单菌落转种营养肉汤,摇床 37 过夜,转速 200 r/min。观察肉汤均匀浑浊,离心(2 500 r/min)1
22、0 min,去上清液,留底层菌体,加入适量无菌生理盐水,冲洗混匀,再次离心(2 500 r/min)10 min,去上清液,加入适量无菌生理盐水制备菌悬液,此为原始菌液。吹打混匀后吸取少量原始菌液作为样品,样品倍比稀释后经比浊仪检测确定稀释液浓度,再乘以稀释倍数推算出原始菌液浓度,最后经换算后倍比稀释,配制出低、中、高 3种浓度菌悬液备用:7.5109 CFU/mL(低)、31010 CFU/mL(中)、61010 CFU/mL(高)。1.2.2分组及造模SPF 级 SD 大鼠 24 只,随机分为 4组,分别为空白组、低菌量组、中菌量组、高菌量组。大鼠称重,腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg
23、),麻醉后将大鼠仰卧位置于动物手术台,固定头部和四肢,抬高鼠板头端,与操作台面成 30角,剃除颈部体毛,暴露颈部皮肤,沿气管走行部位对皮肤进行局部消毒,随后于颈前正中纵向切开皮肤及皮下组织,钝性分离直至暴露气管,用 1 mL 注射器抽吸XDRPA 菌悬液 0.1 mL,在直视下,针头朝向下气道方向,倾斜 30 刺入两软骨环之间,缓慢注入菌液,接种后立即拔出针头,使大鼠保持直立体位 30 s,并左右旋转,使菌液均匀分布至两侧肺部,后立刻利用肌肉层封闭给药穿孔,随后缝合处理颈部切口,消毒,置头稍高位。待麻醉苏醒后,放开大鼠回到鼠笼,自由活动,给予水和饲料。低菌量组、中菌量组、高菌量组分别气管注射
24、0.1 mL 浓度为 7.5109 CFU/mL、31010 CFU/mL、61010 CFU/mL的 菌 悬 液,接 种 量 分 别 为 7.5108 CFU、3109 CFU、6109 CFU;空白组气管注射 0.1 mL 无菌生理盐水。1.3观察指标1.3.1大鼠一般状态造模后观察各组大鼠精神状态、毛发、呼吸、活动、进食、体重等一般情况,观察大鼠有无死亡并记录死亡时间绘制生存曲线。1.3.2肺组织病理学特征无菌操作打开胸腔,观察肺组织大体的病理变化情况,查看肺部体积的大小及颜色、质地的变化,观察肺组织表面是否有出血点、结节、实变等改变。取左肺组织于 4%多聚甲醛溶液中固定 72 h以上,
25、经脱水、包埋、切片、HE 染色,数字病理切片扫描成像系统观察肺组织病理学的变化。1.3.3肺组织细菌学鉴定分离右肺下叶肺组织,称取一定量的肺组织(5070 mg),加入 10 倍体积无菌生理盐水在组织研磨仪中进行研磨,低温匀浆,取 100 L 匀浆液用一次性无菌涂布棒均匀涂布于血平板,将涂好的血平板放入 37 恒温培养箱中孵育 1824 h,观察血平板上菌落的生长情况,并进行细菌学鉴定。1.4大鼠 XDRPA肺炎模型的鉴定根据 PA 肺炎大鼠的临床表现、肺组织病理学特征、肺组织细菌学鉴定结果,结合“主要研究者、病理学专家、微生物学专家”评价意见,达成共识,鉴定大鼠 XDRPA肺炎模型构建成功。
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