蜂胶提取物的体外益生特性研究.pdf
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1、实验研究报告OFJOURNALBEE(Monthly)(月刊)蜜蜂杂志2023年第8 期蜂胶提取物的体外益生特性研究李雅晶,周兵(浙江经贸职业技术学院,浙江杭州310018)摘要:目的:蜂胶是一种具有多种生物活性的天然产物,本文研究了微囊化的杨树属蜂胶醇提物的体外益生特性。方法:利用微胶囊法制备蜂胶,通过2株双歧杆菌属,2 株乳杆菌属,1株片球菌属和1株埃希氏菌属的体外静态发酵评估蜂胶提取物促进益生菌生长及抑制有害菌生长的潜力。结果:蜂胶提取物可不同程度改善乳杆菌、双歧杆菌菌株和片球菌菌株的生长,对大肠杆菌的生长起到抑制作用,并增加短链脂肪酸的生成。结论:蜂胶可促进益生菌的生长,可考虑作为益生
2、元应用于功能食品。1关键词:蜂胶;微囊化;活性成分;体外发酵;益生作用中图分类号:S896文献标识码:A文章编号:10 0 3-9 139(2023)008-0007-07Study on Probiotic Properties ofPropolisExtractinVitroLI Ya-jing,ZHOU Bing(Zhejiang Institute of Economics and Trade,Hangzhou,310018 China)Abstract:Objective:Propolis is a kind ofnatural product with various biolog
3、ical activities.In vitro prebiotics of microencapsulated ethanolextract of Populus propolis(MC-EEP)were studied.Methods:Propolis was prepared by microcapsulemethod,and the potentiality of propolis extractto promote the growth of probiotics and inhibitthe growth of harmful bacteria was evaluated byst
4、aticfermentationof2strainsofBifidobacterium,2 strains of Lactobacillus,1strain of Pediococcus and 1 strain of Escherichia.Results:Propolis extract could improve the growth收稿日期:2 0 2 3-0 5-2 0of Lactobacillus,bifidobacterium and Pediococcusstrains,inhibit the growth of Escherichia coli,and increase t
5、he production of short-chain fattyacids(SCFAs).Conclusion:Propolis can promote thegrowth of probiotics and canbeusedasaprebiotic in functional food.Keywords:Propolis;Microencapsulation;Activeingredient;Invitrofermentation;Prebiotics蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物嫩芽、树皮与树干裂缝处采集树脂,并混人其上颚腺分泌物和蜂蜡经咀嚼加工而成的具有芳香气味的胶状物。它被
6、蜜蜂用于修补蜂巢中的孔隙及包埋食物等,并且在蜂群的整体健康中发挥着重要的作用。蜂胶的成分复杂,由50%55%的树脂、30%40%的蜂蜡、10%的挥发油和芳香油、以及5%10%的花粉、矿物质和维生素等物质组成。从生物学活性成分分析发现,蜂胶中所含的生物活性成分有植物源的多酚类化合物如黄酮类、酚酸及其酯类等,有动物源的腺体分泌物质,如来自于蜜蜂自身的上颚腺、唾液腺分泌物等。因此,蜜蜂品种的不同及蜜蜂采集胶源植物的不同,均会对其生物学活性成分的组成及生物学活性造成大的影响2。蜂胶在长期的使用过程中,已证实具有抗菌、抗氧化、抗炎症、调节代谢等作用。因此,蜂胶作为一种天然药物,在欧洲、南美洲及我国等都在
7、广泛应用。近年来,随着蜂胶研究的深入,研究人员逐渐将蜂胶的化学组成与生物学效应进行了更为精准的关联,逐步确定了在一些肿瘤及炎症治疗中蜂胶与疾病的谱效及量效关系3。因此确定蜂胶的来源及化学组成非常重要。Aug.8OFJOURNALBEE(Monthly)2023NO.8(月刊)蜜蜂杂志益生元是可促进肠道有益菌增殖的物质。目前发现一些植物次生代谢物与肠道微生物间存在相互作用,是益生元的潜在候选物质。对姜黄素等的研究显示,酚类及黄酮类化合物可选择性的刺激肠道中有益菌的生长,抑制有害菌的生长,而肠道中的益生菌可进一步分解这些物质来调节并提高其生物利用度4。中国杨树属蜂胶富含多酚、黄酮类化合物,在此研究
8、中,我们通过前期摸索出的工艺,将蜂胶进行微粒化处理,并在体外与益生菌进行共发酵,分析蜂胶对肠道益生菌的影响,以此探讨蜂胶的益生作用,为蜂胶作为益生元的开发提供依据。1材料与方法1.1材料与试剂蜂胶:杨属型(populus)蜂胶,采集自中国黑龙江省伊春地区;环糊精、碳酸钠、亚硝酸钠:国药集团化学试剂有限公司;芦丁标准品(9 8%),p h y g e n e 公司、没食子酸标准溶液(10 0 0 g/mL),广检(广州)检测科技有限公司;福林酚试剂J(1mol/L),phygene公司;其余试剂均为分析纯。菌种:短双歧杆菌M-16V,长双歧杆菌CECT7894,植物乳杆菌CECT7315,鼠李糖
9、乳酪杆菌GG,戊糖片球菌CECT8330,由迪辅乐生物科技有限公司提供;大肠埃希氏菌ATCC25922,购自北京生物保藏中心。培养基:MRS培养基,培养基成分:酪蛋白陈10.0 g,牛肉膏10.0 g,酵母粉5.0 g,葡萄糖5.0 g,乙酸钠5.0 g,柠檬酸二铵2.0 g,Tween 80 1.0 g,K,HPO42.0 g,MgS047H20 02 g,MnSO4H,0 0.05 g,Ca CO,2 0.0 g,琼脂15.0 g,蒸馏水1.0 L,p H 6.8;LB培养基:10.0 g胰蛋白陈,5.0 g酵母,10.0 g氯化钠,蒸馏水1.0 L,pH6.8混匀后保存于4下备用。标准品
10、:乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、已酸、2-乙基丁酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.2仪器设备7890A气相色谱仪,美国Agilent公司;752Pro紫外可见光分光光度计,上海棱光技术有限公司;PHS-3C酸度计,上海雷磁仪器有限公司;SK8210LHC超声波清洗机,上海科导超声仪器有限公司;ME204E电子天平,梅特勒托利多仪器上海有限公司;旋转蒸发仪RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵SHB-III,郑州长城科工贸有限公司;AG025密闭式厌氧罐,上海坤科仪器设备有限公司;HWS-150恒温恒湿培养箱,上海森信实验仪器有限公司。1.3微囊化蜂胶提取物的
11、制备采用本课题组方法,基本过程如下:取-20预冷的蜂胶,快速粉碎,过筛,备用。加人8 0%乙醇溶液中超声混匀,预设温度28,提取时间30 min,提取3次,过滤得蜂胶醇提液友(ethanol extract of propolis,EEP,10mg/mL)。制备5%-环糊精水溶液。按体积比15:7 边搅拌边将蜂胶醇提液喷洒到环糊精(CD)水溶液中,混合液超声15min,旋转蒸发除去乙醇,冷冻干燥2 4h,制得微囊化蜂胶提取物(microencapsule EEP,MC-EEP)冻干粉。1.4蜂胶有效成分的检测制备含EEP浓度为2 mg/mL的EEP及MC-EEP样品待测。总酚含量采用福林酚法测
12、定6 。以没食子酸为标准品,测定7 6 0 nm波长处的吸光度,制得标准曲线回归方程为y=0.037x+0.0036,R2=0.9 9 9 0;总黄酮含量测定采用GB/T20574-2006亚硝酸铝比色法测定。以芦丁为标准品,测定415nm波长处的吸光度,制得标准曲线回归方程为y=0.0404x-0.0016,R2=0.99991.5菌种活化及体外静态培养双歧杆菌属(短双歧杆菌M-16V,长双歧杆菌CECT7894),乳杆菌属(植物乳杆菌CECT7315,鼠李糖乳酪杆菌GG),片球菌属(戊糖片球菌CECT8330)以0.1%菌量接种于MRS培养基上,埃希氏菌属(大肠埃希氏菌ATCC25922)
13、以0.1%菌量接种于LB培养基上。短双歧杆菌M-16V,长双歧杆菌CECT7894于37 恒温厌氧培养48 h进行菌种活化;戊糖片球菌CECT8330于30 恒温培养48 h进行菌种活化;植物乳杆菌9OFJOURNALBEE(Monthly)(月刊)蜜密蜂杂志2023年第8 期CECT7315,鼠李糖乳酪杆菌GG,大肠埃希氏菌ATCC25922于37 恒温培养48 h进行菌种活化。制备约10 9 个/mL菌悬液作为种子液。将CD和MC-EEP分别作为碳源(CD含量3g/L)取代MRS培养基中的葡萄糖,不含葡萄糖的MRS作为空白(Blank组)。等量添加于LB培养基中。将各种子液以10%的接种比
14、接种于厌氧管中。上述菌均在37 厌氧培养2 4h,测定发酵液的OD600、p H、短链脂肪酸含量。1.6短链脂肪酸的测定短链脂肪酸浓度的测量采用李娟等6 的方法。取离心后的发酵液,按体积比4:1加入2 5%偏磷酸,涡旋混匀后离心,取上清液,待测。色谱条件:Agilent7890A气相色谱仪,FFAP柱E(30m0.32mm0.25m),FID检测器。升温程序:设置初始柱温100,保持1min,然后以4/min升至18 0,之后以2 0/min升至2 0 0,维持5min。设置检测器和进样口温度分别为2 40 和2 0 0,载气、燃气分别为N2、H 2。IN2、H 2 及空气流速分别为2,30,
15、30 0 m L/m in,不分流进样,进样量1L。通过样品峰面积与标准品对比来计算脂肪酸含量。1.7数据分析所有数据采用平均值标准差(文 SD)表示,用GraphPadPrism8软件进行作图与统计分析,两两比较采用t检验,多组间比较先经ANOVA单因素方差分析后,再用Tukey法进行多重比较,以P0.05表示差异有统计学意义。2丝结果与分析2.1蜂胶提取物的总酚、总黄酮含量EEP和MC-EEP的总酚、总黄酮含量见图1。EEP的总酚含量(2 34.52.54mg/g)低于MC-EEP的总酚含量(249.42 6.02mg/g),两者比较有显著性差异P0.05。EEP的总黄酮含量(12 6.0
16、 6 5.41mg/g)略低于MC-EEP的总黄酮含量(142.0 2 9.38mg/g),但无显著性差异。说明蜂胶醇提物的微囊化有利于生物活性成分的溶出,增加蜂胶的利用率。因此,本实验采用MC-EEP进行体外益生实验。本实验样品由浙江养蜂人姜先生于2 0 2 0 年采集自黑龙江省伊春地区。中国幅员辽阔,植物种类南北差异较大,造成蜂胶的胶源植物差异巨大,胶源植物的差别直接影响蜂胶的生物学活性。从张翠平等人的研究来看,产自黑龙江的蜂胶属于典型的杨属型蜂胶,因此,可用总酚、总黄酮含量评价其生物学活性7 。胡福良教授团队的研究显示,杨属型蜂胶的总酚含量在150.8 32.7 5到556.35.55m
17、g/g区间,总黄酮含量在63.75 1.92 至454.9232.67mg/g区间8 。对比可知,本实验样品中的总酚与总黄酮含量较高,因此具有较高的生物学活性。300EEP240.42MC-EEP234,50200-(6/6W)鲁号142.02128.0日100-总酚总黄酮图1EEP与ME-EEP中的总酚、总黄酮含量(n=3)注:*P0.05,*P0.012.2蜂胶提取物对肠道益生菌及条件致病菌生长的影响MC-EEP对短双歧杆菌M-16V,长双歧杆菌CECT7894,植物乳杆菌CECT7315,鼠李糖乳酪杆菌GG,戊糖片球菌CECT8330,大肠埃希氏菌ATCC25922生长的影响见图2。厌氧
18、培养2 4h后,六株菌液均呈现不同程度的浑浊,在6 0 0 nm下测定其吸光度值对生长量进行判定。在接种短双歧杆菌M-16V、长双歧杆菌CECT7894、植物乳杆菌CECT7315、鼠李糖乳酪杆菌GG及戊糖片球菌CECT8330的培养液中,与空白对照组比较,ME-EEP组及CD组菌体生长量均得到了极显著增高(P0.01),说明在厌10Aug.OFJOURNAL2023BEE(Monthly)(月刊)NO.8蜜蜂杂志氧条件下,MRS培养基中缺乏碳源将限制双歧杆菌属、乳杆菌属及片球菌属的微生物的生长,而ME-EEP中的CD可起到碳源作用。同时,总体看来ME-EEP组的促生长作用强于CD组,并且在短
19、双歧杆菌M-16V培养液中存在显著差异早(P0.05);在长双歧杆菌CECT7894、戊糖片球菌CECT8330培养液中存在极显著差异(P0.05),见图2(A)-(E)。说明CD可被这些微生物作为碳源利用,而EEP由于其所含有的多酚、黄酮类生物活性物质促进培养基中营养素的吸收从而促进微生物的生长。这些微生物的生长也可能进一步促使这些生物活性物质的降解及利用9 。培养于LB培养基中的大肠埃希氏菌在厌氧条件下发酵,结果显示,与空白对照组比较,CD组生长量无显著差异,而ME-EEP组极显著降低(P0.01),同时,与CD组比较,ME-EEP组生长量亦显著降低(P0.01),说明在LB培养基中,CD
20、的添加不会对大肠埃希氏菌的生长有影响,而MC-EEP因不仅含有CD还含有EEP,因此对一些致病菌的生长有一定的抑制作用,与玄等的报道相一致110-1。短双歧杆菌M-16V(Bif id o b a c t e r iu m b r e v e M-16 V),长双歧杆菌长亚种中(Bifidobacterium longum subsp.longum),植物乳杆菌(La c tip la n tib a c illu splantarum,鼠李糖乳酪杆菌GG(La c t i c a s-eibacillus rhamnosus GG),戊糖片球菌Pe-diococcus pentosaceus
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