HPLC基本知识介绍.pdf

液相色谱基础液相色谱基础液相色谱基础液相色谱基础HPLC基本知识介绍蒸馏离心电泳过滤超滤色谱常见的分离方式常见的分离方式常见的分离方式常见的分离方式色谱法简介色谱法简介色谱法简介色谱法简介色谱法(Chromatography)溯源 -Tswett应用吸附原理分离植物色素的新方法1906年正式命名(见诸文献)30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于70年代色谱分离的机理色谱分离的机理色谱分离的机理色谱分离的机理分离是一个物理的过程。固定相(Stationary Phase)流动相(Mobile Phase)样品(溶解于流动相中的溶质)什么是液相色谱？什么是液相色谱？什么是液相色谱？什么是液相色谱？色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱HPLCHPLCHPLCHPLC气相色谱HPLC(High Performance LiquidChromatography)高效液相色谱法是一种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱,基于仪器基于仪器基于仪器基于仪器方法的高效能分离手段方法的高效能分离手段方法的高效能分离手段方法的高效能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业无论在技术上无论在技术上无论在技术上无论在技术上,理论上理论上理论上理论上,还是在应用上仍还是在应用上仍还是在应用上仍还是在应用上仍处于发展阶段处于发展阶段处于发展阶段处于发展阶段什么是高效液相色谱什么是高效液相色谱什么是高效液相色谱什么是高效液相色谱(HPLC)？HPLCHPLCHPLCHPLC的仪器配置及流程的仪器配置及流程的仪器配置及流程的仪器配置及流程色谱泵及控制器色谱泵及控制器色谱泵及控制器色谱泵及控制器数据处理及控制数据处理及控制数据处理及控制数据处理及控制进样器进样器进样器进样器色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱检测器检测器检测器检测器W aters 486HPLCHPLCHPLCHPLC的的的的图形图形图形图形结果结果结果结果 -色谱图色谱图色谱图色谱图(Chromatogram)Chromatogram)Chromatogram)Chromatogram)色谱图色谱图色谱图色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.色谱峰色谱峰色谱峰色谱峰时间时间时间时间(分分分分)基线基线基线基线峰高峰高峰高峰高峰宽峰宽峰宽峰宽响应值响应值响应值响应值液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语(1)(1)(1)(1)色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语:色谱峰色谱峰色谱峰色谱峰(Peak):色谱柱流出组分组分组分组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线 峰底峰底峰底峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 峰高峰高峰高峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 峰宽峰宽峰宽峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰 底相交两点之间的距离 半半半半(高高高高)峰宽峰宽峰宽峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰 高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语(2)(2)(2)(2)色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语:峰面积峰面积峰面积峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响 应值 标准偏差标准偏差标准偏差标准偏差()(Standard Error):0.607倍峰高处所 对应峰宽的一半 拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰前伸峰前伸峰前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰鬼峰鬼峰鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语(3)(3)(3)(3)色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语:基线基线基线基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线 基线飘移基线飘移基线飘移基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化 基线噪声基线噪声基线噪声基线噪声(N)N)N)N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动 谱带扩展谱带扩展谱带扩展谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质 阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动 过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语(4)(4)(4)(4)色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语色谱图相关术语:死时间死时间死时间死时间(t t t t0 0 0 0)(Dead time):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间保留时间保留时间保留时间(t t t tR R R R)(Retention time):组分从进样到出 现峰最大值所需的时间 死体积死体积死体积死体积(V V V V0 0 0 0)(Dead volume):不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积保留体积保留体积保留体积(V V V VR R R R)(Retention volume):组分从进样到 出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱的应用（一）液相色谱的应用（一）液相色谱的应用（一）液相色谱的应用（一）“分析型液相色谱”定性及定量分析灵敏度的要求样品的复杂性样品量的要求精度及准确度的要求容易使用液相色谱的应用（二）液相色谱的应用（二）液相色谱的应用（二）液相色谱的应用（二）“制备型液相色谱”分离及纯化化合物的稳定性样品的复杂性制备量的要求纯度的要求，及纯度的鉴定方法的安全性开发液相色谱方法开发液相色谱方法开发液相色谱方法开发液相色谱方法液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数液相色谱实验所需的基本参数:流动相:种类及配比(等度或梯度)固定相:色谱柱类型及内径,长短 流动相输送系统参数:流速 检测器参数:检测波长,灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的以上参数即构成一个具体的以上参数即构成一个具体的以上参数即构成一个具体的HPLCHPLCHPLCHPLC方法方法方法方法,亦称亦称亦称亦称色谱条件色谱条件色谱条件色谱条件评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准问题什么样的分离结果是好的?分辨率?什么是色谱的分辨率？什么是色谱的分辨率？什么是色谱的分辨率？什么是色谱的分辨率？分辨率的公式：)(211212WWVVR+=影响分辨率的因素：影响分辨率的因素：影响分辨率的因素：影响分辨率的因素：K K K K,N N N N分辨率的方程 k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料 的作用强弱。是选择性系数，描述两个组分分离的好坏程度。是化学因素。N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。?+=411 NkkR色谱柱的柱效色谱柱的柱效色谱柱的柱效色谱柱的柱效 N N N N理论塔板数计算公式：W 方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W39 3W416 4W525 521?=WVN容量因子容量因子容量因子容量因子 k k k k 改变k值的方法 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗与峰高的关系与R的关系选择性系数选择性系数选择性系数选择性系数 定义 =1 时两组分分不开，改变的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质120102 kkttttRR=1R，kkkk，N N N N如何控制分辨率如何控制分辨率如何控制分辨率如何控制分辨率?开发液相色谱方法的考虑因素开发液相色谱方法的考虑因素开发液相色谱方法的考虑因素开发液相色谱方法的考虑因素分辨率是色谱分离中主要考虑的因素除分辨率之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考虑:灵敏度载样量分析速度溶剂损耗成本容易使用色谱柱寿命效率色谱图常见问题色谱图常见问题色谱图常见问题色谱图常见问题色谱图常见问题主要有两类:色谱峰峰形异常问题例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等色谱峰保留时间问题保留时间不稳定等色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一一一)色谱峰峰形异常问题:色谱图中未出峰:进样问题:未进样或样品分解流动相问题:泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确,或检测器有问题一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一一一)(续续续续)色谱峰峰形异常问题:所有的峰均为负峰:信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒光学装置尚未达到平衡所有的峰都是宽峰系统未平衡或未达到化学平衡溶样的溶剂比流动相强很多色谱柱类型或尺寸不正确色谱柱或保护柱被污染或降级温度变化对色谱柱的影响色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一一一)(续续续续)色谱峰峰形异常问题:较早洗脱的峰呈宽峰进样体积过大或样品浓度太高进样器有问题,定量环(Loop)大小不合适在线过滤器,保护柱,色谱柱或管路堵塞管路问题:内径不对或切管不正确管路连接问题:接头或锥箍不正确检测器时间常数不正确色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一一一)(续续续续)色谱峰峰形异常问题:峰比预想的要小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确检测器输出未置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一一一)(续续续续)色谱峰峰形异常问题:双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一一一)(续续续续)色谱峰峰形异常问题:拖尾峰保护柱或色谱柱问题:污染或失效进样问题检测器时间常数不正确平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品浓度太高色谱峰保留时间问题:保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(二二二二)色谱峰保留时间问题:保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染,柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(二二二二)(续续续续)色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(二二二二)(续续续续)色谱峰保留时间问题:保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化；柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确液相色谱基础知识思考题液相色谱基础知识思考题液相色谱基础知识思考题液相色谱基础知识思考题(一一一一)色谱分析的基本原理是什么？何谓“固定相”和“流动相”？任何样品都能用液相色谱法分析吗？一套高效液相色谱系统由哪些基本单元组成？何谓保留时间？如何测定？色谱图不出峰,一定是仪器有问题吗？色谱峰峰形不好,一定是仪器有问题吗？液相色谱基础知识思考题液相色谱基础知识思考题液相色谱基础知识思考题液相色谱基础知识思考题(二二二二)写出色谱分辨率的定义式 影响分辨率的主要因素有哪些?影响柱效(理论塔板数)的因素有哪些?何谓“容量因子”?如何改变之?容量因子 越大越好吗?不同品牌的色谱柱的选择性不同,对吗?