白杨素通过下调Annexin A3逆转人肺腺癌A549_DDP细胞顺铂的耐药性.pdf
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1、基础研究白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性刘晖杰,彭荣,许华(湖北文理学院附属襄阳市中心医院 肿瘤科,湖北 襄阳 ;宜城市人民医院 肿瘤科,湖北 襄阳 ;湖北文理学院附属襄阳市中心医院 审计处,湖北 襄阳 )摘要目的观察白杨素对肺腺癌顺铂()耐药性细胞 耐药敏感性的影响。方法取 和 细胞,及 法检测膜联蛋白 ()基因及蛋白表达,法测不同浓度白杨素(、)干预后细胞生存率;将 细胞分为 组、白杨素组()、过表达组(组)、阴性对照组()、白杨素 组,另取 细胞正常培养作为空白对照组;法检测细胞对 的半数生存浓度()及耐药指数;和 法检测 基因和蛋白表达水平,流式细胞义监测细胞凋亡率,小鼠
2、荷瘤实验检测移植瘤体积。结果不同浓度的白杨素均能时效依赖性和剂量依赖性降低 、细胞生存率(),选取 为实验浓度作用细胞 ;与 细胞比较,细胞 及蛋白表达、对 的 、耐药指数均升高,凋亡率降低();与 组比较,白杨素组细胞 、耐药指数、及蛋白表达降低,细胞凋亡率升高(),组细胞 、耐药指数、及蛋白表达升高,细胞凋亡率降低();基因高表达可减弱 细胞对白杨素的敏感性,降低细胞凋亡率();小鼠荷瘤实验证实,与单独的 治疗组比较,白杨素与 联合治疗可显著降低小鼠 移植瘤瘤体体积(),基因高表达的小鼠逆转白杨素与 联合治疗效果()。结论白杨素可能通过下调 表达,逆转 细胞对 的耐药性。关键词肺腺肿瘤;白
3、杨素;膜联蛋白 ;顺铂耐药;细胞 中图分类号 文献标识码 文章编号 ():,(,;,;,)()();(,),(),(),第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 湖北省自然科学基金()引用本文:刘晖杰,彭荣,许华 白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性 贵州医科大学学报,():(),();(),(),(),(),(),();肺癌发病率和死亡率在所有癌症中居首位,肺腺癌是肺癌的一种,属于非小细胞癌类型,多发生于女性 。大多数肺腺癌患者在无法进行手术治疗的情况下,均以顺铂药物()进行化疗治疗 ,但患者在长期使用 时,会产生耐药性,使得治疗效果显著降低 ,因此,改善和扭转
4、癌细胞对 的耐药性,是目前临床研究的重点。膜联蛋白 ()与肿瘤的发生、浸润、转移、血管形成及耐药性等功能有密切关系 ,且已发现其在肺腺癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤细胞中呈较高表达 。近来研究发现,有学者已将 作为卵巢癌铂类耐药的标记蛋白 ,但 是否也与肺腺癌铂类耐药性有关,目前仍未见报道。白杨素是一种天然黄酮类药物,具有抗肿瘤、抗炎等作用,其衍生物可抑制人肺腺癌 细胞生长 ,但其对肺腺癌细胞 耐药性的作用并不清楚。因此本研究通过观察白杨素对肺腺癌 耐药性细胞 对 敏感性的影响,并初步探讨其机制,以期为临床治疗 耐药型肺癌提供参考。材料与方法 细胞来源及主要试剂人肺腺癌细胞 ()及人肺腺癌 耐药细
5、胞株 ()购自上海君润生物,只 小鼠购自西安迪乐普生物医学有限公司 许可证号 (陕),白杨素()购自上海酶研生物科技有限公司,胎牛血清、胰酶、培养基购自上海语纯生物科技有限公司,、反转录病毒试剂盒购自南京锐真生物技术有限公司,试剂盒()、反转录试剂盒()、蛋白提取试剂盒()、试剂盒()购自赛默飞世尔中国公司,反转录试剂盒、检测试剂盒、引物序列购自日本 公司,兔抗人 抗体购自美国 公司,兔抗 美国 ,标记的羊抗兔 购自中国中杉金桥公司,化学发光剂试剂盒()购自上海期刘晖杰等白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性碧云天生物技术有限公司。研究方法 细胞培养及分组将 细胞、细胞快速解冻,并离心
6、收集细胞,用含 胎牛血清的完全培养基悬浮细胞并接种于细胞皿中,置恒温培箱中进行常规传代培养并计数。取对数期 细胞、细胞,以每孔 密度种植于 孔板中适应性培养 后,用 及 法测膜联蛋白 ()基因及蛋白表达。收集对数期 细胞、细胞,以每孔 密度种植于六孔板中,在培养基中分别加入终浓度为 、及 的白杨素干预培养 、,用 法检测 细胞、细胞存活情况,筛选出毒性较低(细胞活性 )的白杨素浓度,作为实验时浓度。取 细胞,以每孔 密度种植于 孔板中,设置为 组、白杨素组()、过 表 达 组(组)、阴性对照组()及白杨素 组;另取 细胞作为 组,每组设置 个复孔。组选用 细胞进行干预培养,白杨素组加入终浓度为
7、 白杨素,组及 组按转染试剂盒说明书方法转染 及 试剂,白杨素 组转染 的同时、加入终浓度为 的白杨素进行干预培养。检测收集各组细胞,加入胰蛋白酶消化,按照 试剂盒说明书步骤对细胞进行处理,用酶标仪检测 波长下吸光值,细胞生存率()(药物处理组吸光值 空白组吸光值)。细胞半数生存浓度()及耐药指数检测上述细胞加入终浓度为(、)继续干预培养 ,按 法测细胞在 波长下的吸光值,绘制生存曲线,取细胞生存率为 时的浓度为 ,根据公式,耐药指数 给药组 空白组 ,计算各组细胞的耐药指数。荧光实时定量 ()取细胞,弃去培养基,离心后收集细胞,用 试剂盒抽提细胞总 ,反转录合成 ,反应体系为 (,逆转录酶,
8、样品),置于 、,下 灭活逆转录酶活性;将 稀释 倍按照实时荧光定量 试剂盒对 进行扩增。反应体系为 ,正向引物、反向引物各 ,去离子水 。反应条件:,预热 ,上述 步骤 次循环,终止反应。以 为内参基因,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用 算法计算 相对表达量,实验重 复 次。正 向 引 物 ,反向引物 ;正 向 引 物 ,反向引 物 。蛋白质免疫印迹取各组细胞,弃去培养基,加入 裂解液裂解后提取总蛋白,用 试剂盒测定总蛋白浓度后,转移至 膜上,加入适宜浓度的兔抗人一抗 (),孵育 、洗涤后加入 标记的二抗(羊抗兔 ),室温孵育,洗涤,以 为内参,通过 显影,凝胶成像系统照相并
9、分析灰度值。试验重复 次。流式细胞仪监测细胞凋亡取培养 后的各组细胞,加入终浓度为 培养 后,参照文献 收集细胞,重悬制成单细胞悬液,加入 异硫氰酸荧光素和碘化丙啶试剂各 染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡。小鼠荷瘤实验验证白杨素对细胞耐药性的影响取()的 小鼠 只,分为 组、组、白杨素组()、过表达组(组)、阴性对照组()及白杨素 组,每组 只,组小鼠经皮下注射 只(个 )的 细胞;后,给予 腹腔注射 ,次 ;组小鼠除注射细胞为 细胞外,其余同 组;白杨素组小鼠皮下注射等量 细胞后 ,给予 腹腔注射的同时注射白杨素(,只)进行干预治疗;组及 组小鼠分别皮下注射转染 及 的 细胞(只,个 )后 ,
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