藏药诃子质量标志物诃黎勒酸的标准化分析研究.pdf
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1、分析测试新成果(140 148)藏药诃子质量标志物诃黎勒酸的标准化分析研究宋志博1,5,陈涛1,5,王肖波2,王岱杰3,申诚1,王硕1,李洪梅1,5,海平4,李玉林1(1.中国科学院 西北高原生物研究所,青海 西宁810001;2.中国科学院 西北生态环境资源研究院,甘肃 兰州730000;3.山东省分析测试中心,山东 济南250014;4.青海省药品检验检测院 国家药品监督管理局中药(藏药)质量控制重点实验室,青海 西宁810016;5.中国科学院大学,北京100049)摘要:以藏药诃子为原料,研制诃黎勒酸国家标准样品.诃子经 60%乙醇提取,大孔树脂富集,制备液相色谱技术得到诃黎勒酸标准品
2、.采用高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)和薄层色谱(TLC)等手段进行纯度分析.采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、高分辨质谱(MS)和核磁共振波谱(NMR)技术进行结构确认.最后进行均匀性、稳定性和联合定值.结果表明,诃黎勒酸样品均匀性良好,4 储存,24 个月内稳定.联合定值确定诃黎勒酸纯度标准值为 99.33%,符合国家标准品的要求.研制出的诃黎勒酸(GSB 11-3724-2020)国家标准样品,可用于含量测定、检测方法评定、相关产品的检测与质量控制.关键词:诃黎勒酸;标准样品;均匀性;稳定性;定值中图分类号:TQ460.7+2 文献标志码:B 文章编号:100
3、6-3757(2023)02-0140-09DOI:10.16495/j.1006-3757.2023.02.002Standardization of Chebulagic Acid as Quality Marker of TibetanMedicine Terminalia ChebulaSONG Zhibo1,5,CHEN Tao1,5,WANG Xiaobo2,WANG Daijie3,SHEN Cheng1,WANG Shuo1,LI Hongmei1,5,HAI Ping4,LI Yulin1(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Ch
4、inese Academy of Sciences,Xining 810001,China;2.NorthwestInstitute of Eco-Environment and Resources,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China;3.ShandongAnalysis and Test Center,Jinan 250014,China;4.Qinghai Provincial Drug Inspection and Testing Institute,NMPA Key Laboratory for Quality Contro
5、l of Traditional Chinese Medicine and Tibentan Medicine,Xining810016,China;5.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)Abstract:A certified reference material of chebulagic acid has been developed using a Tibetan medicine TerminaliaChebula as the raw material.Terminalia Chebula
6、was extracted with 60%ethanol,enriched by the macroporous resin and 收稿日期:20230302;修订日期:20230516.基金项目:青海省重点研发与转化计划:藏药质量标志物发掘和标准化关键技术及应用示范(2023-SF-112),甘肃省青年科技基金计划(20JR5RA542)Key Research,Development and Transformation Plan of Qinghai Province:KeyTechnologies of the Exploration and Standardization of
7、Quality Markers from Tibetan Medicine and Its ApplicationDemonstration(2023-SF-112),Gansu Youth Science and Technology Fund Program(20JR5RA542)作者简介:宋志博(1995),男,硕士研究生,研究方向:藏药物质基础和标准化研究,E-mail:通信作者:海平(1964),男,研究员,研究方向:中藏药药理及质量控制研究,E-mail:;李玉林(1970),男,博士,研究员,分析测试技术与仪器编委,研究方向:藏药标准化与创新药物研究,E-mail:.第 29 卷
8、第 2 期分析测试技术与仪器Volume 29 Number 22 0 2 3 年 6 月ANALYSIS AND TESTING TECHNOLOGY AND INSTRUMENTSJune 2023 through the preparative liquid chromatographic purification to obtain chebulagic acid.The purity analysis was carried outby high performance liquid chromatography(HPLC),liquid chromatography-mass sp
9、ectrometry(LC-MS)and thin-layerchromatography(TLC).The structure was identified using ultraviolet(UV)spectroscopy,infrared(IR)spectroscopy,mass spectroscopy(MS)and nuclear magnetic resonance(NMR)spectroscopy.Finally,the homogeneity,stability andcooperative certification were carried out.The results
10、indicated that the chebulagic acid has a good uniformity and a finestability within 24 months at 4.The standard value of the purity of chebulagic acid was 99.33%,which was inaccordance with the requirements of the certified reference material.The developed chebulagic acid(GSB 11-3 724-2020)can be us
11、ed for the content determination,method evaluation,testing and quality control of related products.Key words:chebulagic acid;reference material;homogeneity;stability;certification 标准样品是经过技术鉴定,附有有关性能数据证书的一批样品,可以用来校准仪器、评价测量方法、给材料赋值1-2.天然产物标准样品的地位在中药现代化的发展中日益凸显,特别是在检测结果的准确性、溯源性和药材质量控制方面起着不可替代的作用3-6.藏药诃
12、子是使君子科植物诃子 Terminaliachebula Retz.干燥成熟果实,长圆形或卵圆形,表面黄棕色或暗棕色.诃子味苦、酸、涩,性平,归肺、大肠经,用于久泻久痢、便血脱肛、肺虚喘咳、久嗽不止、咽痛音哑等症状7.诃子在藏药中具有重要地位,在卫生部药品标准藏药第一册(部颁标准)常用 200则藏药方剂中,使用诃子入药的有 125 种,素有“藏药之王”的美称8.诃子中化学成分十分丰富,主要包括鞣质类、酚酸类、三萜类、黄酮类、挥发油类、脂肪族类等9.目前市售诃子的质量参差不齐,更是有伪品混杂其中,药典中对诃子的质量控制局限于性状、显微及薄层色谱鉴别,缺乏对质量标志性成分的含量测定.在诃子质量标志
13、物预测研究报道中,经多个角度的预测分析表明诃黎勒酸是可能的质量标志物之一10,具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌等药理作用11-15.目前,国内外还未研发出诃黎勒酸的国家标准样品.本研究围绕诃子中的质量标志成分诃黎勒酸,参照标准样品工作导则,开展了标准化分析研究,成功研制了诃黎勒酸国家标准样品(GSB 11-3724-2020)(如图 1 所示).1试验部分 1.1仪器本试验所用仪器信息如表 1 所列.1.2原料与试剂诃子购自西宁市八一药材市场,由青海民族大学热增才旦教授鉴定为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)的成熟干燥果实.高效液相色谱(HPLC)中所用甲醇、乙
14、腈、乙酸均为色谱纯(武汉弗顿控股有限公司),水为实验室自制超纯水,其余试剂为分析纯.1.3方法 1.3.1样品制备取诃子果实 10 kg,粉碎,60%乙醇溶液为提取溶剂,料液比 110,超声提取 1 h,过滤,滤液浓缩后冷冻干燥,得到粗提物.注入粗提物水溶液于D101 大孔吸附树脂层析柱(20 cm160 cm),静置吸附 24 h 后,先用大量 30%乙醇溶液洗脱,边洗脱边用 HPLC 检测,直至洗脱液中无化合物,再用 50%乙醇溶液洗脱,制备液相色谱对 50%乙醇洗脱部位分离,得到诃黎勒酸标准样品.样品经 HPLC 分析,色谱柱:Agela Innoval C18(250 mm4.6 mm
15、,5 m).流动相:甲醇0.5%乙酸水溶液.洗脱程序:030 min,45%80%甲醇.流速:1.0 mL/min.柱温:30.检测波长:274 nm.运行时间:30 min.OOOHOHOHHHOOOO123456OHHOHOHOOHHOOOHOHOHOOHOOCOOHOHHH123456172345671234567HO12345671234576图 1诃黎勒酸的化学结构Fig.1Chemical structure of chebulagic acid第 2 期宋志博,等:藏药诃子质量标志物诃黎勒酸的标准化分析研究141制备液相分离条件,色谱柱:Reprosil 100 C18(250
16、mm20 mm,10 m).流动相:甲醇水(体积比为 4555).流速:18 mL/min.检测波长:281 nm.1.3.2纯度分析(1)薄层色谱分析.采用乙酸乙酯甲醇三氟乙酸(体积比为 510.01)和丙酮甲醇三氟乙酸(体积比为 41.250.01)两种展开体系进行检测分析,GF254 硅胶板,梯度点样.(2)HPLC 分析.色谱柱:Agela Innoval C18(250mm4.6 mm,5 m).流动相:乙腈0.5%乙酸水溶液(体积比为 1486).流速:1.0 mL/min.柱温:30.检测波长:200400 nm.运行时间:30 min.(3)液相色谱-质谱(LC-MS)分析.色
17、谱柱:Agela Innoval C18(250 mm4.6 mm,5 m).流动相:乙腈0.5%乙酸水溶液(体积比为 1090).流速:1.0 mL/min.运行时间:30 min.柱温:30.MS 条件:电喷雾离子源(ESI).毛细管电压 4.0 kV.载气:N2.载气流速:10 L/min.载气温度:550.扫描范围:m/z 为 501 500.1.3.3水分和灰分含量测定依据 GB 606-2003化学试剂水分测定通用方法卡尔费休法和文献 16,测定水分和灰分含量.1.3.4结构确证通过紫外(UV)、红外(IR)、质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)技术对样品进行结构确认.1.3.5均
18、匀性检验技术依据:GB/T 15 000.3-2008 第 7 章17,随机抽取 10 瓶样品,分别将其按 110 编号,按第一次编号顺序:1-3-5-7-9-2-4-6-8-10;第二次编号顺序:10-9-8-7-6-5-4-3-2-1;第三次编号顺序:2-4-6-8-10-1-3-5-7-9 的程序分别从每瓶中称取 3 份 0.5 mg 样品,经 HPLC 分析,测定其纯度值.采用方差分析法对采集的数据进行分析18-20.瓶间方差 s2,瓶间标准偏差 sbb,重复性标准偏差 sr分别使用式(1)(3)计算:s2=MSamongMSwithinn(1)sbb=MSamongMSwithinn
19、(2)sr=MSwithin(3)均匀性检验的不确定度 ubb=sbb.式中,MSwithin为瓶内均方差,MSamong为瓶间均方差,n 为样品组数.1.3.6稳定性检验(1)短期稳定性:以 6 d 为期,随机抽取 15 瓶已分装样品,平均分成 5 组,分别放置于20、28、20、40、60 保存.对诃黎勒酸样品进行 HPLC 分析,每份试样测定 2 次,取其平均值为定值结果.(2)长期稳定性:以 2 年为期,样品储存于 04 条件下.分别在第 0、6、12、18、24 月,取样检测,每份试样测定 5 次,取平均值,使用 t 检验对数据进行统计分析.s(b1)斜率 b1,截距 b0,直线上点
20、的标准偏差 s2,与斜率相关的不确定度分别使用式(4)(7)计算:b1=ni=1(XiX)(YiY)ni=1(XiX)2(4)b0=Y b1X(5)s2=ni=1(Yib0b1Xi)2n2(6)表 1 仪器型号Table 1Models of instruments仪器名称仪器型号公司液相色谱质谱仪Agilent 6520 Q-TOF美国安捷伦公司高效液相色谱仪Agilent 1260美国安捷伦公司大孔树脂纯化柱50 L浙江温兄机械阀业有限公司循环超声提取仪CTXNW-100B北京弘祥隆生物技术股份有限公司红外光谱仪Vertex 70德国布鲁克公司核磁共振波谱仪BRUKER 400 MHz德国
21、布鲁克公司热重分析仪SHIMADZU TG-40 DTA-40M日本岛津公司高效制备液相色谱仪LC-8A岛津日本岛津公司冷冻干燥机GLZ-1B上海浦东冷冻干燥设备有限公司142分析测试技术与仪器第 29 卷s(b1)=sni=1(XiX)2(7)XY式中,n 为测量次数,Xi为每次检测月数,Yi为每次测得的纯度(%),为月平均数,为纯度平均数.自由度为 n-2 和 p 为 0.95(95%置信水平)的分布 t 因子等于 3.182.1.3.7定值如表 2 所列,采用多个实验室进行协作定值,随机抽取 24 瓶样品,平均分配至每个实验室,每瓶HPLC 测定 2 次.表 2 参加定值实验室及仪器型号
22、 Table 2Laboratories participated in calibration and models of instrument序号实验室名称HPLC仪器型号1北京市理化分析测试中心Shimadzu LC-20A2中国科学院新疆理化技术研究所Waters e26953山东大学化学与化工学院Waters 26954山东省科学院生物研究所Agilent 12005山东省中医药研究院Waters e26956山东蓝城分析测试有限公司Agilent 12007济南市出入境检验检疫局Agilent 12608山东省分析测试中心Agilent 1260 xu(x)测定总平均值 x,实验室
23、内重复性标准偏差 sr2,实验室间再现性标准偏差 sL2,实验室总平均值的标准偏差 s(),实验室总平均值的不确定度分别使用式(8)(12)计算:x=mi=1nij=1xijN(8)s2r=MSwithin(9)s2L=(MSamongMSwithin)/n(10)s(x)=s2L/p+s2r/np(11)u(x)=s(x)(12)其中,m 为样品瓶数,ni 为第 i 瓶测定的次数,xij为某一次测定值,N 为测定总次数,p 为定值实验室数量,n 为单个实验室检测次数.1.3.8不确定度评价u(x)标准样品定值不确定度、均匀性不确定度ubb、短期稳定性不确定度 usts、长期稳定性不确定度 u
24、lts、水分不确定度 u水和灰分不确定度 u水组成了标准样品的总不确定度 uCRM.u(x),ubb,usts,ults分别使用式(13)(16)计算:u(x)=s(x)(13)ubb=sbb=(MSamongMSwithin)/n(14)usts=s(b1)stststs(15)ults=s(b1)ltstlts(16)式中:s(b1)sts、s(b1)lts分别为短期、长期稳定性直线斜率的不确定度,tsts、tlts分别为短期、长期稳定性有效时间.u水和 u灰包括仪器产生的不确定度 u1和测量重复性产生的不确定度 u2.u水和 u灰由公式(17)计算,uCRM使用式(18)计算:u水=u灰
25、=u12+u22(17)uCRM=2u(x)2+ubb2+ults2+usts2+u水2+u灰2(18)2结果与讨论 2.1样品分离制备诃黎勒酸富集组分的 HPLC 分析色谱图如图 2所示.t/min吸收强度/mAU501001520253050100150200250诃黎勒酸图 2样品 HPLC 分析色谱图Fig.2HPLC chromatogram of sample第 2 期宋志博,等:藏药诃子质量标志物诃黎勒酸的标准化分析研究143经计算,HPLC 分析时,诃黎勒酸在甲醇质量分数为 55%时被洗脱.但制备液相以 55%甲醇等度分离时,化合物洗脱过快,分离效果差.如图 3 所示,在甲醇质
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