萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响.pdf
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1、Vol.41 No.2Jun.2023第 41 卷 第 2 期2023 年 6 月经 济 林 研 究 Non-wood Forest Research收稿日期:2022-09-20基金项目:河南省科技重大专项(201300110900);国家自然科学基金项目(32071752)。第一作者:刘玉芳(),硕士研究生。通信作者:张党权(),教授,博士,博士研究生导师;何功秀(),副教授,博士,硕士研究生导师。引文格式:刘玉芳,刘芬,宋宇坤,等.萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响 J.经济林研究,2023,41(2):272-281.LIU Y F,LIU F,SONG Y K,et
2、 al.Effects of extraction methods on antibacterial and antioxidant activities of the extracts from Rosmarinus officinalis processing residuesJ.Non-wood Forest Research,2023,41(2):272-281.萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌 和抗氧化活性的影响刘玉芳1,刘 芬2,宋宇坤1,张春玲3,马菁华1,马冬丽1,张盼盼1,李明婉1,赖 勇1,丁 申1,何功秀4,张党权1(1.河南农业大学 林学院,河南 郑州 450002;
3、2.抚州市林业科学研究所,江西 抚州 344000;3.河南省新密市林业局,河南 郑州 452370;4.中南林业科技大学 林学院,湖南 长沙 410004)摘 要:【目的】为实现迷迭香提取精油后残渣的高值化利用提供参考。【方法】以迷迭香提取精油后固体残渣为原料,分别采用溶剂提取(CSE)、超声波辅助提取(UAE)、超临界CO2萃取(SC-CO2)和亚临界萃取(SE)4 种方法对有效组分进行提取,采用液相色谱-四级杆-高分辨串联质谱仪进行成分分析,通过分析对 DPPH、ABTS、羟基等 3 种自由基的清除能力综合评估所得提取物的抗氧化能力,采用抑菌圈、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MB
4、C)3 个指标评价提取物的抑菌效果。【结果】4 种提取物中的主要活性物质为鼠尾草酚、齐墩果酸和熊果酸等萜类化合物,木樨草素、橙皮素、香叶木苷和橙皮苷等黄酮类化合物,以及鼠尾草酸和绿原酸等酚酸类化合物。采用 4 种方法所得提取物均具有显著的抗氧化效果,其抗氧化能力由强到弱依次为 SC-CO2、CSE、UAE、SE。采用 4 种方法所得提取物均对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)有明显的抑制作用,对金黄色葡萄球菌的抑菌效果由强到弱依次为 SC-CO2、SE、CSE、UAE,对枯草芽孢杆菌的抑菌效果由强到弱依次为 SC-CO2、SE、UAE、CSE,其中采用 SC-CO2所得提取物对蜡状芽
5、孢杆菌有明显的抑制作用;综合分析对 5 种供试菌种的抑菌圈、MIC 和 MBC,抑菌能力由强到弱依次为 SC-CO2、UAE、SE、CSE。【结论】SC-CO2为回收迷迭香加工残渣抗氧化和抑菌成分的最优途径。关键词:迷迭香;加工残渣;萃取方法;抗氧化;抑菌中图分类号:S573+.9 文献标志码:A 文章编号:10038981(2023)02027210Effects of extraction methods on antibacterial and antioxidant activities of the extracts from Rosmarinus officinalis proce
6、ssing residuesLIU Yufang1,LIU Fen2,SONG Yukun1,ZHANG Chunling3,MA Jinghua1,MA Dongli1,ZHANG Panpan1,LI Mingwan1,LAI Yong1,DING Shen1,HE Gongxiu4,ZHANG Dangquan1(1.College of Forestry of Henan Agriculture University,Zhengzhou 450002,Henan,China;2.Research Institute of Forestry Science,Fuzhou 344000,J
7、iangxi,China;3.Xinmi Forestry Bureau,Zhengzhou 452370,Henan,China;4.Central South University of Forestry&Technology,Changsha 410004,Hunan,China)Abstract:【Objective】To provide the reference for the high value utilization of the rosemary solid waste.【Method】The effective components of the rosemary pro
8、cessing residue were extracted by solvent extract(CSE),ultrasonic-assisted extraction(UAE),supercritical CO2 extraction(SC-CO2)and subcritical extraction(SE),respectively,and three free radical scavenging capabilities of DPPH,ABTS and hydroxyl group were evaluated by the antibacterial sphere,minimum
9、 antibacterial concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC).【Result】The main active substances Doi:10.14067/ki.1003-8981.2023.02.028http:/273第 41 卷经 济 林 研 究迷迭香 Rosmarinus officinalis(异名 Salvia rosmarinus),是唇形科的多年生芳香常绿灌木,原产地为环地中海沿岸地区,已在我国成功引种并得到广泛推广。迷迭香富含各种天然生物活性物质,具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌等作用,
10、被广泛应用于化妆品、医药、食品添加剂和生物防治等方面。迷迭香的传统用途主要为食用和药用,其叶片被广泛用作香料和调味料1,叶片和枝条的煎剂被用来治疗低血压、腹痛、腹泻,叶片的浸液被用于滋补、镇咳、祛痰、抗哮喘、退热和抗麻痹2。迷迭香还具有良好的驱虫、抑制杂草、水土涵养等生态功效,已被用作油茶等经济林的套种经济作物3。迷迭香精油作为传统的多用途精油,具有高抗氧化和抑菌活性,有利于人体健康以及食品保存。随着对迷迭香精油活性成分研究的逐步深入,迷迭香精油在食品加工、芳香理疗、医学和其他领域的应用也逐步增多。然而,在植物精油制备过程中,通过水蒸气蒸馏将植物中的精油成分提取出后,剩余大量的固体残渣,目前精
11、油残渣未得到高值化的开发利用。填埋或焚烧是精油残渣的常规处理方式,不仅成本高,还会引起环境问题4,可通过深加工实现高值化利用并减少产业污染5。近年来,国内外关于芳香植物固体残渣的开发利用研究主要集中在堆肥、动物饲料和生物吸附等方面6。研究结果表明,迷迭香叶片提取精油后的固体残渣中仍含有鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等具有抗氧化活性的物质,其中鼠尾草酸对油脂具有较好的抗氧化活性,迷迭香酸有明显的抗炎症、抗氧化、免疫抑制等药理作用,这些活性物质在化妆品、药品与食品等生产领域均存在巨大的应用潜力7-8,传统的利用方式并未充分发挥这些精油残渣的剩余价值。使用适宜的萃取方法将这些活性成分提取出来
12、,了解提取物的抗氧化与抑菌等生物活性,可为其高值化利用提供科学依据9。萃取方法对残渣中活性物质的回收与利用具有重要影响,使用不同萃取方法所得提取物中活性成分的含量和种类存在差异。了解使用不同萃取方法所得提取物活性成分的共性和差异,有利于根据不同用途的要求,选择适宜的萃取方法,可为迷迭香加工残渣中活性成分的高效提取与利用提供理论依据。溶剂提取是最常用的迷迭香天然抗氧化成分提取方法,虽成本低且易于扩大规模,但存在选择性低和溶剂残留等缺点。毕良武等10采用极性溶剂和非极性溶剂的两步提取法从迷迭香中提取抗氧化剂成分,提取率为 16.08%,其中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸等活性成分的含量分别为 17.
13、78%、6.23%和 3.37%。超声波辅助提取是通过将发射超声波的探头直接插到混有原料的溶剂中,使原料直接受超声波的作用,促使原料中的有效成分快速溶于溶剂中,具有操作简便、工艺周期短、有效成分不被破坏等优点。罗小芳等11采用超声波辅助提取法从迷迭香叶中提取鼠尾草酸,提取率高达 93.6%,表明超声波辅助提取能显著提高鼠尾草酸的提取效率。超临界CO2萃取具有超低温、无毒、可回收等优势12,且不破坏有效成分的活性,常被用于提取迷迭香酚类化合物13。亚临界萃取也具有低温、无毒、可回收等优点,不易破坏有效成分,且提取溶剂用量少,适合用于工业化生产,目前已开始被用于迷迭香精油提取及抗氧化剂制备14。本
14、试验中选取上述 4 种萃取方法,对迷迭香加工残渣进行提取对比研究,解析不同萃取方法of rosemary and essential oil residue extract was sage phenol,cidun acid and guago acid,melago,hesperidin,gerinin and hesperidin flavonoids,and sage acid and chlorogenic acid organic acids.All four extracts showed significant antioxidant effects.The comprehen
15、sive evaluation of its antioxidant capacity was successively decreased as:SC-CO2,CSE,UAE,SE.All four extracts significantly inhibited gram-positive bacteria(Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis).the antibacterial effects on Staphylococcus aureus were observed successively decreased as:SC-CO2,
16、SE,CSE,UAE.The antibacterial effect on Bacillus subtilis was observed successively decreased as:SC-CO2,SE,UAE,CSE,among which,SC-CO2 showed significant inhibition of Bacillus cereus.The bacteriosphere diameter was(10.710.78)mm.Considering the antibacterial coil diameter,MIC and MBC of the five teste
17、d species,the antibacterial ability was successively decreased as:SC-CO2,UAE,SE,CSE.【Conclusion】SC-CO2 can be regarded as a new way with better antioxidant and antibacterial effects from the rosemary processing residue.Keywords:Rosmarinus officinalis;processing residue;extraction methods;antioxidati
18、on;bacteriostasis274第 2 期刘玉芳,等:萃取方法对迷迭香加工残渣提取物抑菌和抗氧化活性的影响下迷迭香加工残渣的活性成分及其抗氧化与抑菌活性,筛选具有前景的最优萃取方法,从而为迷迭香残渣的抗氧化剂和抑菌产品的高值化开发利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器样品:在河南省禹州市禾丰农业发展有限公司的迷迭香种植基地进行采样,采样部位为当年生成熟叶片。将迷迭香叶片采摘后,进行自然晾干。晾干后的迷迭香叶片通过水蒸气蒸馏法提取精油后的剩余物即迷迭香加工残渣。菌种:金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆
19、菌Escherichia coli、沙门氏菌 Salmonella、蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 均由河南农业大学经济林实验室提供,各菌种已经过鉴定。仪器:XH-2008DE 智能温控双频超声波合 成/萃取仪购自北京祥鹄科技发展有限公司,亚临界双溶剂萃取仪购自河南省亚临界生物技术有限公司,SFE-2 超临界流体萃取仪购自美国 Applied Separations 公 司,Gen5 酶 标 检 测 仪 购 自 美 国Biotek 公司,Heraeus Megafuge 8R 高速冷冻离心机购自郑州金友宁仪器有限公司,Q-Exactive Plus System 液相色谱-四级杆
20、-高分辨串联质谱仪购自美国 Thermo Fisher 公司。1.2 试验方法1.2.1 成分提取样品前处理:将迷迭香加工残渣放入烘箱完全干燥后取出,用粉碎机粉碎、过筛(孔径 0.18 mm),得到迷迭香加工残渣粉末。1)溶剂提取(conventional solvent extraction,CSE)。称取 15.0 g 迷迭香加工残渣粉末,加入300 mL 无水乙醇,加热回流 2 h,抽滤提取液,将抽滤后的提取液进行旋转蒸发,浓缩至 20.0 mL 左右,放入烘箱烘干,收集备用15-16。2)超声辅助提取(ultrasoni-assisted extraction,UAE)。称取 1.5
21、g 迷迭香加工残渣粉末,加入37.5 mL 无水乙醇,提取 2 h,提取温度为 50,抽滤提取液,将抽滤后的提取液进行旋转蒸发,浓缩至20.0 mL左右,放入烘箱烘干,收集备用17。3)超临界CO2流体萃取(supercritical CO2 fluid extraction,SC-CO2)。称取 8.0 g 迷迭香加工残渣粉末,加入体积分数为 95%的乙醇作为夹带剂,夹带剂与迷迭香粉末的质量比为 25,萃取压力4104 kPa,萃取 3 h,收集萃取物烘干备用18。4)亚临界萃取(subcritical extraction,SE)。称取100 g迷迭香加工残渣,加入1.5 L的正丁烷,提取
22、 0.5 h,得到膏状提取物,烘干备用。1.2.2 成分分析采用液相色谱-四级杆-高分辨串联质谱仪对迷迭香加工残渣提取物进行成分分析。色谱条件:采用 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱(150 mm3 mm,1.8 m);以 0.1%甲酸水溶液为流动相 A,以 0.1%甲酸乙腈为流动相 B,线性梯度类型为 ramp;柱温 30,进样盘温度4,自动进样 5 L。0 15 min,B 从 5%变为95%;15 18 min,B 保持 95%;18 20 min,B 从 95%变为 5%;20 23 min,B 保持 5%,流速 0.3 mL/min。质谱条件:可加热的电喷雾离
23、子源(HESI),正离子扫描模式,喷雾电压 3.50 kV,毛细管温度350,辅助气加热温度 200,雾化氮气压强3.5104 Pa,辅助气压强 7.0104 Pa,离子扫尾气压强 3.5103 Pa,鞘气流速为 40 L/min,辅助气为 10 L/min。采用 Full Ms/dd-MS2 扫描模式,一级全扫描分辨率为 70 000,自动增益控制目标离子数为 1106;扫描范围 80 1 000 m/s,二级扫描分辨率为 17 500,自动增益控制目标离子数为 2105;分离窗口 1.0 m/z,碰撞能为 20%、40%、60%。利用TraceFinder 3.3软件,结合谱库进行目标物的
24、定性,建立目标物筛查方法 OTCML Screening,匹配度分值不小于 80。采用面积归一法进行定量分析,得出相对含量。1.2.3 抗氧化能力分析1)DPPH 自由基清除能力测定。将提取物用无水乙醇按二倍稀释法稀释成 2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 mg/L 质量浓度梯度的溶液,将维生素 C 用去离子水稀释成相同质量浓度梯度的溶液作为阳性对照,将 20 L 待测样品溶液和 180 L DPPH 工作液在 96 孔板中混合,室温下避光反应 30 min 后,用酶标仪在 517 nm 波长下测定吸光度,每个样品和对照均重复测定 3 次。R1=1-(A1-A2)
25、/A0100%。式中:R1为 DPPH 清除率;A0为无水乙醇与 DPPH 工作液的混合溶液的吸光度;A1为 DPPH 工作液与不同浓度迷迭香提取物或维生素 C 混合溶液的吸光度;A2为不同浓度提取物与无水乙醇混合溶液的吸光度。2)ABTS 自由基清除能力测定。将浓度为 7 mmol/L 的 ABTS 溶液与 2.45 mmol/L 过硫酸钾275第 41 卷经 济 林 研 究溶液等体积混合,室温避光放置 16 24 h,即储存液,用无水乙醇稀释,制得在 734 nm 处吸光度为 0.700.02 的工作液,备用。将提取物用无水乙醇按二倍稀释法稀释成 2、4、8、16、32、64、128、25
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