T_CI 121-2023 RNA定量测序技术规程.docx
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1、ICS07.080CCSC 04 团体标准T/CI 1212023RNA 定量测序技术规程The technical procedure of RNA quantitative sequencing2023 - 08 - 31 发布2023 - 08 - 31 实施中国国际科技促进会发 布目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 缩 略语15 质量控制要求26 RNA 核酸样品采集方法37 总 RNA 核酸样品完整度检测48 RNA 建库59 高通量测序仪质控及测序1210 数据分析12前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规
2、则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国国际科技促进会提出并归口。 本文件起草单位:深圳承启生物科技有限公司、武汉承启医学检验实验室有限公司、暨南大学、华南理工大学、赛哲生物。 本文件主要起草人:张 弓、陈 洋、余 卓、王 鑫、卢少华、金静洁、杜红丽、卢 红、陈 杰。 RNA 定量测序技术规程1 范围本文件确立了用于高通量转录组测序的总RNA核酸类样品的转录组测序和质控全流程,包括样本采集、处理、运输、检测和数据产生和质量评估分析全流程。本文件适用于从新鲜动植物组织、新鲜可培养细胞、全血和细菌/真菌等样品中提取的真核生物和原核生物的
3、总RNA样本的测序。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 35537-2017 高通量基因测序结果评价要求 GB/T 40664-2021 用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求 T/CHIA 21.4-2021 组学样本处理与数据分析标准 第4部分:转录组文库构建 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高通量基因测序 high-throughput gene sequencing区别于传统双脱氧(San
4、ger)测序,一种能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术,通常一次测序反应能产出不低于100 Mb的测序数据。来源:GB/T 30989-2014,3.19 3.2转录组定量测序 whole transcriptome quantitative sequencing是通过新一代测序技术全面测定某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列,通过对序列的统计分析确定每种转录本的量。 3.3文库 library通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等所得到的一个重建分子群,如基因组文库、互补DNA文库、噬菌体展示肽文库等。 来源:GB/T 30989-2014,3.5 3.4测序片段 reads高
5、通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。 来源:GB/T 35890-2018,3.2 3.5Q30测序数据中,碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%,或错误率为0.1%。 来源:GB/T 40226-2021,3.64 缩略语下列缩略语适用于本文件。 RNA:核糖核苷酸(Ribonucleic acid) DeoxyriboNucleic acid) rRNA:核糖体RNA(Ribosomal RNA) bp: 碱 基 对 (Base pair) OD:光密度(Optical density) Trizol:总RNA抽提试剂(TRIpure Reagent) PCR:聚合
6、酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) DNB:DNB纳米球(DNA nanoball) NCBI:美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) RefSeq:RNA参考序列库(RNA reference sequences collection) FANSe3 : 超高精度的高速序列比对算法( Fast and Accurate mapping algorithm for Next-generation Sequencing, the 3rd generation) 5 质量控制要求5.1 通
7、用要求5.1.1 生物样本及相关数据的使用应遵守区域、国家和国际的伦理规范。 5.1.2 样本质量要求应通过完整性和样本浓度确定,达到 GB/T 40664-2021 的总 RNA 样品质量要求。 5.1.3 用于高通量测序的核酸类样本应根据 GB/T 35537-2017 中 4.1 和 4.2 中的碱基测序准确率的要求进行质量控制。 5.1.4 使用 MHCC97H 细胞来源的 RNA 标准品进行转录组测序,对测序仪状态进行评估:按测序仪推荐的上样量进行测序,测序采用 PE150 模式进行,对第一端数据进行分析,使用 FANSe3 将 reads 比对到NCBI refseq 人类标准参考
8、转录组,FANSe3 设置参数为-E5 -I1,比对率80%,Q3080%,说明仪器和试剂状态良好,可进行待测样品的转录组高通量测序。 5.1.5 所有使用的化学试剂均要求至少分析纯。 5.2 动植物组织、培养细胞、全血和细菌/真菌样本量要求根据不同样品类型和不同测序目标准备足量样品,在条件许可情况下,尽量加倍准备样品量,并做好样品备份工作,表1为推荐样品量。 表1 推荐样品量样品类型 推荐样品量 新鲜动物组织 200 mg 新鲜植物组织 300 mg 新鲜培养细胞 3106 个 全血 1 mL 细菌/真菌菌体 300 mg 5.3 RNA 样品运输要求5.3.1 RNA 样品如果需要运输,应
9、尽量溶于足量 Trizol 后运送(Trizol 的体积应不小于 RNA 溶液体积的 5 倍,并充分混合均匀),尽量送往距离最近的实验室进行后续实验操作。 5.3.2 如需低温运送,应使用足够多的冰袋和保温盒,保证整个运输过程中的温度。低温运送时不应使用干冰。 5.3.3 空运时可使用普通 0C 冰袋或-20C 封闭式冰盒,以防止温度过低而使塑料管变脆破裂。应使用旋盖密封管或气密性包装,以免因气压变化造成管盖弹开。 5.3.4 不同运送距离和时间,推荐运输条件见表 2。 表2 RNA 样品推荐运输条件距离到达时间建议运输条件小于 200 公里 当天 常温 200 公里至 1200 公里 当天
10、常温 陆运 2 天 常温,也可加 0C 冰袋 1200 公里至 2500 公里 陆运 3 至 4 天或空运 2 天 普通 0C 冰袋 大于 2500 公里 空运 3 天 普通 0C 冰袋 陆运 7 至 10 天(需谨慎) -20C 封闭式冰盒 5.4 总 RNA 核酸样本质量要求5.4.1 总 RNA 完整性本文件同时满足高完整度RNA样品和轻微降解RNA样品建库和测序要求。 对于高完整度RNA样品,总RNA样本的完整性应符合GB/T 40664-2021的要求。通过凝胶电泳分析总RNA的rRNA的28S/18S(真核样品)和23S/16S(原核样品)rRNA比值进行判断,rRNA条带亮度比值
11、接近2:1,rRNA条带明亮完整,说明无明显降解。 若样品因较长时间暴露在空气中或反复冻融的轻微降解RNA样品,若经凝胶电泳显示样品的rRNA条带勉强能分辨,28S/18S(真核样品)或23S/16S(原核样品)rRNA亮度比值低于2:1,或有明显拖尾, 通常仍可按照本流程获得与未降解样品一致性较高的结果。 5.4.2 总 RNA 浓度和纯度样本总RNA浓度应大于1 ng/L。RNA样本纯度:OD260/280=1.82.05。提纯后的RNA中应确保无酚类污染,UV吸收光谱最高峰应在260 nm 3 nm。 5.5 转录组建库样本质量要求对常见的动物、真菌等物种,包括人、鼠、水稻、酵母等,推荐
12、使用的投入总RNA量为10 ng-1 g。对于如水稻、拟南芥等植物mRNA丰度较低的物种,建议提高投入总RNA量至1 g-2.5 g。当样本轻微降解可适当增加投入量,总投入量一般不超过2.5 g。 6 RNA 核酸样品采集方法6.1 样品前处理不同样品种类,样品前处理操作见表3: 表3不同种类样品前处理方法样品类型处理方法无细胞溶液(如细胞培养上清、血清,包括已提纯好溶于水的RNA) 至少加入溶液体积5倍以上的Trizol,充分混匀。蛋白质浓度特别高时(如血清)建议至少加入10倍以上体积的Trizol。 动物细胞(培养细胞)、植物原生质体 直接溶于足量Trizol中。 动物组织、临床组织块 大
13、块的组织不易溶解,需低温快速剪成或切成0.5 mm3以下的小块。由于组织离体后RNA会随着时间变化而变化,且RNA更易降解,因此若剪碎时间较长,请在液氮中研磨。Trizol 的量要加足,建议按10倍体积来加。部分组织可能较难溶解,可用涡旋振荡器剧烈振荡, 或用枪头、玻璃棒、金属棒等碾碎,使其均匀溶于Trizol,无沉淀。骨组织等无机盐含量高的组织块最终无法全部溶解,属正常现象。 细菌 微量台式离心机3000 rpm - 6000 rpm 3 min-10 min离心收菌,勿使用过高离心力。弃上清,溶于Trizol,可能需要剧烈涡旋振荡或枪头反复吹打才可完全溶解。部分细菌(尤以革兰阳性菌为甚)细
14、胞壁非常厚,难以良好溶于Trizol,造成RNA提取效率极低。遇到这种情况请在收菌后用溶菌酶先进行破壁,再使用Trizol。极端情况下请于低温下使用细菌磨、French Press、Cell cracker等设备进行快速破壁后再溶于Trizol,但切记动作要快细胞破碎后RNA降解会很迅速,即便是在4C条件下。 样品类型处理方法植物组织 由于植物组织次生代谢产物极其复杂,常含有多糖多酚,不同组织差异极大,因此可先将组织在液氮中碾碎,然后溶于足量Trizol,离心取上清。若提取效率低下,建议采用试剂盒或CTAB法提取RNA,再按无细胞溶液溶于Trizol。 6.2 总 RNA 样品提取方法总RNA
15、样品提取方法如下: a) 每 1000 微升 Trizol 加入 0.2 mL 氯仿,剧烈混匀(可涡旋)15 s,室温放置 3 min,可观察到样品开始分层; b) 12000 g, 4C 离心 15 min,使样品分成三层; c) 小心吸取上层水相,约 600 L,转移至新的 1.5 mL EP 管中,注意操作时不要吸取到中间层液体; d) 加入 800 L 异丙醇,倒置混匀;如样品中 RNA 很少,可加入 1 L 糖原帮助沉淀; e) 置于-20C 静置,如只需测定真核生物中的成熟体 mRNA,静置 1h;如果需测定原核生物 RNA 或真核生物的 lncRNA、小 RNA 等,需静置 8h
16、; f) 12000 g,4C 离心 30 min,去除上清液; g) 加入 1 mL 75% 乙醇(需-20C 提前预冷 30 min); h) 7500 g, 4C 离心 5 min,去除上清; i) 重复步骤 6.2 g)、6.2 h)一次; j) 去除残留的乙醇,打开管盖,风干约 5 min 至管底无明显液体残留; k) 加入无 RNA 酶的纯水溶解,此步骤得到总 RNA 样品,置于-80C 冰箱保存。 7 总 RNA 核酸样品完整度检测采用凝胶电泳分析法检测RNA完整度。凝胶电泳检测总RNA样本完整性结果见图1。 注: 左边第一泳道为指示核酸分子大小的一系列核酸分子,从上到下分子量大
17、小分别为:2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp;其余泳道为真核细胞总RNA样品。样品均为完整度高的总RNA样品,上样量为 2 g。图1 琼脂糖凝胶电泳评估总 RNA 提取的纯度和完整度8 RNA 建库8.1 基因组 DNA 去除RNA易被DNA污染,若不去除基因组DNA容易影响测序质量。需先用DNase I去除 DNA 并纯化后再开始后续实验,具体操作如下: a) 反应体系见表 4; 表4 DNA 去除反应液组分投入质量或体积Total RNA 1 g 10X reaction buffer with MgCl2 1 L DNase I,RNa
18、se-free 1 L(1U) RNase-Free Water to 10 L b) 37C 孵育 30 min; c) 加入 1 L 50 mM EDTA 60C 孵育 10 min 终止 DNase I 反应; d) 去除基因组后的 RNA 马上进行 mRNA 富集。 8.2 mRNA 富集(根据需要,两种方法选其一)8.2.1 rRNA 去除法富集 RNA非真核生物RNA样品或降解严重的RNA样品,推荐采用rRNA去除法对RNA进行富集。使用对应物种的rRNA去除试剂盒富集RNA后,直接进入步骤8.3 RNA片段化。 8.2.2 磁珠法富集 RNA一般情况下,完整或轻微降解的真核生物R
19、NA样品推荐使用Vazyme的Library Preparation VAHTS mRNA Capture Beads进行mRNA捕获: a) 将 mRNA Capture Beads 从 2C-8C 取出,静置使其温度平衡至室温; b) 准备 RNA 样品:在一个 Nuclease-free PCR 管中,用 Nuclease-free H2O 将 0.01 g-12.5 g 总 RNA 稀释至 50 L,冰上放置备用; c) 涡旋振荡 mRNA Capture Beads 充分混匀,吸取 50 L 加入到总 RNA 样品中,用移液器吹打至少 10 次以彻底混匀; d) 将样品置于 PCR
20、仪中,65C 5 min,25C 5 min,4C hold,使 mRNA 结合到磁珠上; e) 将样品置于磁力架 5 min,使 mRNA 与总 RNA 分离;小心移除上清; f) 将样品从磁力架上取出,用 200 L Beads Wash Buffer 吹打 6 次以彻底混匀,在磁力架上静置 5 min,小心移除上清; g) 将样品从磁力架上取出,用 50 L Tris Buffer 重悬磁珠;用移液器吹打 6 次以彻底混匀; h) 将样品置于 PCR 仪中,80C 2 min,25C hold,将 mRNA 洗脱下来; i) 加入 50 L Beads Binding Buffer,用移
21、液器吹打 6 次以彻底混匀; j) 室温放置 5 min,使 mRNA 结合到磁珠上; k) 将样品置于磁力架 5 min,使 mRNA 与总 RNA 分离;小心移除上清; l) 将样品从磁力架上取出,用 200 L Beads Wash Buffer 吹打 6 次以彻底混匀,在磁力架上静置 5 min,小心移除全部上清; m) 加入 12 L Nuclease-free H2O,用移液器吹打 6 次充分混匀,将样品置于 PCR 仪中,80C 2 min,立即置于磁力架上 5 min,待溶液澄清后,小心吸取 10 L 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中; n) 剩余的 2
22、 L 于 NanoDrop 仪器检测 mRNA 富集后浓度,一般浓度大于 0.5 ng/L 都可进入后续RNA 文库构建; o) mRNA 富集后样品可置于-20C 短暂保存,建议立即进入 RNA 文库构建。 8.3 RNA 片段化mRNA文库进行二代测序应将步骤8.3至8.10替换为T/CHIA 21.4-2021中4.1.3至4.1.9章节中的普通转录组建库流程进行;本流程基于MGIEasy mRNA文库制备试剂盒进行标准文库构建,最终将使用基于DNA纳米球与联合探针锚定聚合技术结合的测序技术平台对mRNA文库进行二代测序。其他二代测序技术与之大同小异,可参照执行。 a) 向 mRNA 富
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