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实验室液相色谱仪检定规程摘要
一 概 述
实验室液相色谱仪(以下简称仪器)是由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和数据记录处理装置等几部分组成的分析仪器。图1是典型的液相色谱仪组成方框图。它利用样品中各组份在色谱柱中固定相和流动相间分配系数或吸附系数的差异，将各组份分离后进行检测，并根据各组份的保留时间和响应值进行定性、定量分析。
输液泵 进样器 色谱柱 检测器 数据记录 处理装置
图1 液相色谱仪组成方框图
二 技术要求
1 外观
1.1 仪器应有下列标志：名称、型号、制造厂名、出厂日期、系列号(或编号)等。
1.2 仪器要成套、完整。
1.3 仪器各调节旋钮、按键、开关等能正常工作，无松动。指示灯灵敏。
1.4 电源线、信号电缆等插、接头与插座紧密配合。
1.5 输液管路应为不锈钢管，接头紧密、牢固，在规定的压力范围内无泄漏。
2 输液系统
2.1 泵流量设定值误差SS：小于±2％～5％；*流量稳定性误差SR，小于±2％～3％。
2.2 梯度准确度误差Tci：小于3％。
3 柱恒温箱温度设定值误差ΔT：小于±2℃，控温稳定性误差Tc：小于或等于1℃(无柱箱仪器不检此项)。
4 定性、定量测量重复性
4.1 *定性测量重复性误差(8次测量)RSD定性：小于或等于1.5％。
4.2 *定量测量重复性误差(8次测量)RSD定量：小于或等于3.0％。
5 检测器性能
5.1 紫外－可见光检测器
5.1.1 固定波长紫外检测器波长示值误差：小于±2 nm。
5.1.2 可调波长紫外－可见光检测器波长示值误差：小于±2 nm；重复性误差：小于±1 nm。
5.1.3 *基线漂移：小于或等于5×10－3(AU/h)。
基线噪声：小于或等于5×10－4(AU)。
5.1.4 最小检测浓度(静态)：4×10－3g/mL(萘的甲醇溶液)。
5.1.5 线性范围：大于或等于103。
5.1.6 吸光度选择器换档误差：小于或等于2.0％。
5.2 荧光检测器
5.2.1 波长示值误差：小于±5 nm(固定和可调波长)。
5.2.2 *灵敏度：10－8g/mL硫酸奎宁溶液在记录仪上有满量程70％以上的响应(检测器范围档置最小，记录仪输入电压与检测器输出电压相同)。
5.2.3 *基线漂移：小于或等于±5×10－3(AU/h)。
基线噪声：小于或等于±5×10－4(AU)。
5.2.4 *最小检测浓度：5×10－10g/mL(硫酸奎宁的硫酸水溶液)。
5.2.5 线性范围：大于或等于103。
5.2.6 范围选择器换档误差：小于或等于2.0％。
5.3 差示折光检测器
5.3.1 *灵敏度：10－4g/mL丙三醇水溶液在记录仪上有满量程70％以上的响应(范围选择器置最小档，记录仪输入电压与检测器输出电压相同)。
5.3.2 *基线漂移：小于或等于±5×10－6(RIU/h)。
基线噪声：小于或等于±5×10－7(RIU)
5.3.3 最小检测浓度：5×10－6g/mL(丙三醇水溶液)。
5.3.4 线性范围：大于或等于103。
5.3.5 范围选择器换档误差：小于或等于2.0％。
三 检定条件
6 环境条件
6.1 安装仪器的房间应清洁无尘，无易燃、易爆和腐蚀性气体，室内排风良好。
6.2 仪器应平稳地放在工作台上，便于操作，周围无强烈的机械振动和电磁干扰，仪器接地良好。
6.3 环境温度为10～30℃，8小时内温度波动不超过±3℃(有RI检测器的，温度变化不要超过±2℃)，相对湿度低于85％。
7 电源要求
7.1 电源电压：220±22 V
7.2 电源频率：50±0.5 Hz
8 检定设备
8.1 秒表，分度值小于0.1 s，经检定合格。
8.2 分析天平，最大称量200 g，最小分度为0.1 mg，经检定合格。
8.3 容量瓶，50 ml 10个。
8.4 铜-康铜热电偶及配套测温仪表，经检定合格。
8.5 水银玻璃温度计，0～50℃(分度：0.1℃)，一支，经检定合格。
8.6 数字多用表(5位半)(或数字电压表)：0～200 mV(和仪器配套使用的记录仪，经校准后可以代替数字多用表)。
8.7 注射器：10 μL，50 μL各两支，经校准。10 mL两支。
8.8 标准物质和试剂*：萘、硫酸奎宁标准物质、丙三醇、异丙醉、丙酮等试剂其等级和所配溶液的浓度及配制方法详见附录4。
8.9 甲醇、HPLC用纯水、硫酸等溶剂和试剂。
8.10 紫外吸光标准溶液(一套)。
四 检定项目和检定方法
9 按第1.1～1.4款说明进行仪器外观检查。
10 泵的耐压检定：将仪器的输液系统，进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，流量设为1 mL/min，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，用滤纸检查各管路接头处应无湿迹。卸下色谱柱，堵住泵出口端(压力传感器以下)，使压力达到最大允许值的90%，保持5分钟无泄漏。
11 泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定。
在第10条实验条件下，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集10～25分钟，称重。按式(1)、式(2)计算SS和SR。
SS＝(Fm－FS)/FS×100% (1)
SR＝(Fmax－Fmin)/ F- ×100% (2)
式中：SS——流量设定值误差(％)；
Fm＝(W2－W1)/ρt·t，流量实测值(mL/min)；
W2——容量瓶＋流动相的重量(g)；
W1——容量瓶的重量(g)；
FS——流量设 定值(mL/min)；
ρi——实验室温度下流动相密度g/cm3)；
t——收集流动相的时间(min)；
SR——流量稳定性误差(％)；
Fmax——同一组测量中流量最大值(mL/min)；
Fmin——同一组测量中流量最小值(mL/min)；
F-——同一组测量值的算术平均值(mL/min)。
表 1 SS、SR 的 检 定
流量设定值(mL/min)
0.5 1.0 2.0
测量次数
3 3 3
收集流动相时间(min)
25 15 10
SS
5% 3% 2%
允许误差SR
3% 2% 2%
注： 流量最高值的设定可根据实验室的要求而定。流量测量顺序可以随意选择，但不是设定某一流量后连续测量三次，每次改变流量后至少要等5分钟待流量稳定后，方可收集流动相。
12 柱恒温箱温度设定值误差ΔT和控温稳定性误差Tc的检定。
柱恒温箱有孔可以插入温度计的，可将温度计插入柱箱，并设法固定住。没有孔的柱箱，可将热电偶固定在柱箱中央(冷端在室温下)，引线接到测温仪表上，关好柱箱门。
选择最低可控温度(通常为室温10℃)和最高可控温度的90％两点进行检定。按仪器说明书操作，开始升温。待指示温度稳定后，记下温度或测温表上指示值，每隔10分钟记录一次，共计7次，求出算术平均值。设定值与平均值之差为△T，7次测量值中最大与最小值之差为控温稳定性误差Tc。
13 梯度准确度的检定
通过梯度控制装置设置阶梯式的溶剂梯度程序。A溶剂为水，B溶剂为含0.1％丙酮的水溶液，A从100％变到0。开机后先以A溶剂走基线(流功相不经过色谱柱)，基线平稳后使用记录仪的仪器，调好零点后记下记录仪读数，使用计算机积分仪的仪器，记下输出电信号值。然后执行梯度程序，画出梯度变化曲线，并读出各种溶剂配比时的输出电信号值或记录仪读数。重复测量两次，求出平均值。从B溶剂的含量及相对应的输出电信号值或记录仪读数Lmi和L- m 值计算梯度准确度Tci，取Tci值最大值者作为仪器梯度准确度误差。
Tci＝(Lmi－L- m )/L- m×100% (3)
式中：Tci——第i段梯度准确度(％)；
Lmi——第i段输出信号值或记录仪读数；
L- m——各段输出信号或记录仪读数平均值。
0 % A 100 % B 80 % B 60 % B 40 % B 20 % B 100 % A 0%B
输出信号值或记录仪读数
图2 梯度准确度的检定
14 定性、定量测量重复性的检定
将仪器联接好，使之处于正常工作状态，用微升注射器(最好用定量管)注入适当量的标准溶液(紫外-可见光检测器用萘，蒽、联苯等；荧光检测器用硫酸奎宁、艹屈 等；差示折光检测器用丙三醇或葡萄糖等)，或者稳定的待分析样品，记录保留时间和峰面积，连续测量8次，按式(4)计算相对标准偏差RSD。

RSD定性(定量)，即为定性定量测量重复性相对标准偏差。
式中：Xi——第i次测得的保留时间或峰面积；
X-——n次测量结果的算术平均值；
i——测量序号；
n——测量次数。
15 紫外-可见光检测器性能的检定
15.1 固定波长紫外检测器波长示值误差的检定固定波长紫外检测器通常是用一块滤光片获得指定波长的光，可小心将滤光片取出送到高精度的分光光度计上检定。
15.2 可调波长紫外——可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定
将检测器与记录仪联接好，接通电源预热稳定后，用注射器分别将紫外吸收标准溶液和参比溶液注入到检测器的样品池和参比池中，将两池冲洗干净，然后将两池充满，按紫外吸收标准溶液的标准波长(235 nm，257 nm，315 nm和350 nm)检定仪器的波长示值误差。将记录纸速调到4 mm/min，将检测器波长凋到较标准波长低5 nm处(例如检定257 nm时，检
测器波长先调到252 nm)，调记录笔到中间位置，然后每15秒改变1 nm，从252nm变到262 nm，记录仪上画出如图3的曲线，曲线最低处(透过最大)对应的波长与标准波长之差为波长示值误差。用同样的方法检定其它几点，每点重复测3次，最大与最小值之差为波长重复性误差。
15.3 基线漂移和基线噪声的检定
按说明书将仪器各部分联接好，选择如下的实验条件：紫外吸收波长为254 nm，流动相为100％甲醇；流量为1.0 mL/min，参比池为空气；吸光度选择为最灵敏档；记录纸速为5～10 mm/min，开机待基线稳定后，记录基线30～40分钟，计算基线漂移和噪声。
t时间
252 253 254 255 256 257 262 261 260 259 258
记录仪读数(吸光度)
记录仪读数(透过率)
图3 波长示值误差和重复性误差的检定
15.4 最小检测浓度的检定
在静态条件下，用注射器注入4×10－8g/mL萘的甲醇溶液，样品峰高应大于或等于两倍基线噪声峰高，按式(5)计算最小检测浓度
cl ＝2·HN·c/H (5)
式中：cl ——最小检测浓度(g/mL)；
HN——噪声峰高(记录仪格数或实测高度cm)；
c——样品浓度(g/mL)；
H——样品峰高(记录仪格数或实测高度cm)。
15.5 线性范围的检定
将冷测器和记录仪联接好，接通电源，以2％异丙醇水溶液为甲溶液、丙酮－2％异丙醇系列水溶液为乙溶液，紫外吸收波长为254 nm，在静态下用甲溶液冲洗吸收池若干次，待记录仪指示稳定后，将记录笔调到零，依次将0.1％，0.2％、……1.0％丙酮－2％异丙醇乙溶液注入并充满吸收池，同时记下各溶液的记录仪读数。重复3次，取算术平均值，作丙酮含量－读数平均值图，找出曲线拐点(读数值较理论值低5％处)，此为线性范围的上限ch，按式(5)计算出丙酮的cl值，由ch/cl，(丙酮)算出检测器的线性范围。
15.6 吸光度选择器换档误差的检定
在检测器输出端接一只数字多用表(或直接用经校淮过的与仪器配套用的记录仪，有显示吸光度功能的仪器不需此多用表)，在仪器正常工作状态下，依次按下选择器按键，在数字表上读出相应的电位值或记录仪上的数值或显示器上的吸光度值，重复测量3次，取算术平均值，计算相邻两档换档误差Hi，取Hi最大值表示换档误差。
Xi Yi－Xi＋1 Yi＋1
Hi＝
Xi Yi
100%
(6)
式中：Xi——第i档标示值；
Yi——选择器置第i档时记录仪或数字表读数。
16 荧光检测器性能的检定
16.1 波长示值误差的检定
固定波长荧光检测器有两块滤光片，可取下在标准分光光度计上检定。可调波长荧光检测器可参照第15.2款的方法进行(若仪器使用正常，此项可以不检)。
16.2 基线漂移和基线噪声的检定
将检测器与记录仪联接好，仪器预热稳定后，用注射器分别将丙酮和水(5 mL左右)注入流动池中(出口处接一小烧杯)，重复几次，将池冲洗干净后，再注入5 mL丙酮，堵住出口，5分钟后注入5 mL 0.05 mol/L 的H2SO4水溶液(注意不要有气泡)，将灵敏度选择开关置于最灵敏档，记录基线30分钟，由此计算基线噪声和基线漂移(记录纸速为10 mm/min)。
16.3 灵敏度和最小检测浓度的检定
将检测器与记录仪联接好，灵敏度选择最灵敏档，激发波长为345 nm，发射波长455 nm(固定波长型仪器不设置波长)用注射器慢慢向流动池中注入3 mL左右0.05 mol/L 的H2SO4水溶液，接通电源，几分钟后记录笔有反应，调节凋零旋钮，使记录笔处于记录纸零点处，然后用注射器将10－8g/mL的硫酸奎宁的0.05 mol/L的硫酸水溶液注入流动池记录笔应处于满量程的70％以上的以置，由此计算检测器灵敏度，再按cl ＝ 2·HN·c/H式计算最小检测浓度(各符号的意义与式(5)同)。
16.4 线性范围的检定
采用第16.3款的实验条件，范围选择置于中间位置，用注射器向流动池中注入0.05 mol/L 的H2SO4水溶液，将池冲洗干净。然后依次向池中注入1×10－5，2×10－5，3×10－5…1×10－4g/mL的硫酸奎宁的H2SO4水溶液，同时记下记录仪读数，重复3次取算术平均值，以硫酸奎宁浓度与记录仪读数作图，求出曲线拐点(读数较理论值低5％处)。此点为线性上限ch。由第16.3款得cl值，ch/cl比值为线性范围。
16.5 范围选择器换档误差的检定
操作、计算方法于第15.6款相同。
17 差示折光检测器性能检定
17.1 基线漂移和基线噪声的检定
将检测器及仪器与其它部分联接好，接通电源预热后，以纯水为流动相，流量为1 mL/min，参比池充纯水，范围选择在最小档，待仪器稳定后记录基线30分钟，计算出基线漂移和基线噪声(实验中应特别注意室温的波动)。
17.2 灵敏度和最小检测浓度的检定
将检测器与色谱柱拆开，用蒸馏水冲洗样品池多次后，再用3次水冲洗，范围选择最灵敏档，记录仪输入电压与检测器输出电压相同，记录笔调至零位。用注射器将10－4g/mL丙三醇水溶液注入样品池，记录笔应处于满量程的70％以上的位置。重复3次，取算术平均值由此计算检测器的灵敏度。根据第17.1款测得的基线噪声及式(5)计算最小检测浓度。
17.3 线性范围的检定
将样品池于参比池用3次水反复冲洗后，依次向池中注10－6，10－5，10－4，10－3，2×10－3，3×10－3，4×10－3，5×10－3g/mL丙三醇水溶液，同时记下记录仪读数。以丙三醇浓度与记录仪读数作图，求出曲线拐点(读数较理论值低5％处)。此点为线性上限ch。由第17.2款得cl值，ch/cl比值为线性范围。
17.4 范围选择器换档误差的检定
操作、计算方法与第15.6款相同。
说明：检定中使用的色谱柱均为ODS-反相柱
五 检定结果处理和检定周期
18 按本规程条款检定，至少带*的检定项目都达到规定技术指标的仪器，为合格仪器，发给检定合格证书。
若有一个带*的项目不合格，如是检测器，可发给合格证书，但注明该检测不合格。如是其它项目，则该仪器为不合格仪器，未达到技术指标的不合格仪器发给检定结果通知书。
19 实验室液相色潜仪的检定周期暂定为两年，若更换部件或对仪器性能有怀疑时，应随时检定。