miR-24-3p在骨肉瘤中的表达及其抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭迁移的实验研究.pdf
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1、3353.MODERNONCO1,No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学miR-24-3p在骨肉瘤中的表达及其抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭迁移的实验研究万宁军,陶亚梅,郝斌,许少伟,王王真1宁夏回族自治区人民医院脊柱骨肿瘤科;心脏重症监护室,宁夏银川7 50 0 0 2【摘要】目的:探讨miR-24-3p在骨肉瘤中的表达及调控骨肉瘤细胞生物学行为的作用。方法:收集我院骨肉瘤标本及配对癌旁组织标本10 例,RT-qPCR检测骨肉瘤组织及癌旁组织中miR-24-3p的相对表达量。MG-63细胞转染miR-24-3pmimics或miR-24-3pinhibitor后,RT-qPC
2、R检测miR-24-3p干扰及过表达效率。通过CCK-8及EdU实验评估骨肉瘤细胞增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测骨肉瘤细胞迁移与侵袭能力。Westernblot检测PCNA蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果:与癌旁组织相比,骨肉瘤组织及细胞中miR-24-3p表达显著下调。敲降miR-24-3p表达后,CCK-8及EdU实验结果表明MG-63细胞增殖能力增加,划痕实验和Tranwell实验结果显示MG-63细胞迁移与侵袭能力增加,流式细胞术结果显示细胞调亡降低(P0.001)。过表达miR-24-3p表达后,CCK-8、划痕实验和Tranwell实验结果显示MG-63细
3、胞增殖、迁移与侵袭能力减弱,细胞调亡增加(P0.01)。Westernblot结果显示miR-24-3pmimics组PCNA蛋白表达降低,miR-24-3pinhibitor组PCNA蛋白表达增加。结论:miR-24-3p在骨肉瘤组织及细胞中表达下调,并且可以抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞调亡,发挥抑癌作用,有望成为骨肉瘤治疗的靶点之一。【关键词】骨肉瘤;miR-24-3p;细胞增殖;细胞迁移与侵袭【中图分类号】R738.1【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.18.004【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)18-33
4、53-0 7miR-24-3p expressed in osteosarcoma and inhibited the proliferation,invasion andmigration of osteosarcoma cellsWAN Ningjun,TAO Yamei?,HAO Bin,XU Shaowei,WANG ZhenDepartment of Spinal and Bone Tumour;Department of Coronary Care Unit,Peoples Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region,NingxiaYinch
5、uan750002,China.Abstract1 Objective:To investigate the expression of miR-24-3p in osteosarcoma and the role of regulating thebiological behavior of osteosarcoma cells.Methods:Ten osteosarcoma specimens and paired para-cancer tissue spec-imens from our hospital were collected.RT-qPCR was used to dete
6、ct the relative expression of miR-24-3p in os-teosarcoma and para-cancer tissues.MG-63 cells were transfected with miR-24-3p mimics or miR-24-3p in-hibitor,and RT-qPCR detected the interference and overexpression efficiency.The proliferation of osteosarcoma cellswas evaluated by CCK-8 and EdU assays
7、,and the migration and invasion were assessed by scratch assay and Tran-swell assay.The expression of PCNA protein was detected by Western blot.Cell apoptosis was detected by flow cytom-etry.Results:The expression of miR-24-3p in osteosarcoma tissues and cells was significantly down-regulated byRT-q
8、PCR.The proliferation of osteosarcoma cells was increased by CCK-8 and EdU assays when the miR-24-3p expression was down-regulated.The migration and invasion ability of osteosarcoma cells was increased by scratchand Transwell assay,while cell apoptosis was decreased by flow cytometry(P0.001).The pro
9、liferation of osteosar-coma cells was inhibited by CCK-8 and EdU experiments when the miR-24-3p expression was up-regulated.The migration and invasion of osteosarcoma cells were inhibited by scratch and Transwell experiments after miR-24-3p overexpression,while cell apoptosis was increased(P 1 cm,术后
10、病理证实无癌细胞浸润),术中骨肉瘤组织及癌旁组织取材后装入冻存管立即放人液氮中冷冻保存。本研究通过我院伦理委员会批准实施1.1.2细胞系人骨肉瘤细胞系MG-63、U-2 0 S、Sa o s-2 及人正常成骨细胞系hFOB1.19购自武汉Procell生命科技公司。1.1.3主要试剂TRIzol裂解液(Invitrogen),mi Rc u t e 增强型miRNA荧光定量试剂和miRNAcDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司),CCK-8检测试剂盒(凯基生物),AnnexinV-FITC/PI双染调亡检测试剂盒(联科生物),RIPA强裂解液(碧云天),BCA蛋白含量检测试剂盒(凯基生
11、物),BDMatri-gelMatrix基质胶(美国BD公司),EdU-594细胞增殖检测试剂盒(武汉赛维尔),PCNA一抗及GAPDH一抗(Protein-tech),LipfectamineTM2000(Invitrogen)。1.2实验方法1.2.1生物信息分析在CEO数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)查询骨肉瘤组织或细胞系miRNA测序数据集,最终确定GSE28423数据集,该数据集包括19个骨肉瘤细胞系,4个正常骨组织标本的miRNAs测序数据,以正常骨组织为对照组,使用CGEO2R在线分析细胞系中miRNA表达水平,并绘制火山图,筛选表达上调
12、及下调的miRNAs。1.2.2细胞培养及转染本研究中使用骨肉瘤细胞系(U-2OS、M G-6 3、Sa o s-2)和正常成骨细胞系(hFOB1.19)购自武汉普诺赛生命科技有限公司,全部细胞通过STR基因分型验证。细胞置于含10%胎牛血清培养基,于37、5%CO2培养箱中进行细胞培养。miR-24-3pmimics或miR-24-3p inhibitor转染采用脂质体介导的瞬时转染。miR-24-3pmimics序列(5-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3),miR-24-3p inhibi-tor序列(5-CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA3),由通用生物股份有限
13、公司合成。实验分为miR-24-3pmimics组、mimics NC组、miR-24-3p inhibitor组、inhibitor NC组。转染选择6 孔细胞培养板,细胞铺板后观察细胞融合度达8 0%进行瞬时转染操作。按瓶壁说明加入无菌DEPC水溶解miR-24-3pmimics及miR-24-3pinhibitor,浓度为2 0 mol/L。将 10 L miR-24-3p mimics 或 miR-24-3p inhibitor加人到2 50 L无血清培养基中稀释并吹打混匀,使miRNA转染时终浓度为10 0 nmol/L;吸取5LLipfectamineTM2000加人到2 50 L
14、无血清培养基,混匀后室温静置5min。细胞换液后加人无血清培养基1.5mL。将两种混合液混匀后室温静置2 0 min,加人细胞培养板中,6 h后换液更换为完全培养基,继续培养48 h后进行后续实验1.2.3RT-qPCR检测骨肉瘤细胞及组织中miR-24-2p表达经过总RNA提取、逆转录及荧光定量PCR反应。用TRIzol法提取细胞和组织的总RNA。测定总RNA浓度后,使用加尾法逆转录合成cDNA。取1g总RNA,使用miRNAcDNA第一链合成试剂盒逆转录成cDNA。使用miRcute增强型miRNA荧光定量试剂盒进行荧光PCR反应,配置2 0L反应体系,95预变性15min。PCR反应95
15、2 0 s,6034s 共40 个循环。溶解曲线参数:9515s,606 0 s,9515s。以U6为内参,用公式2-ACt计算骨肉瘤细胞及组织中miR-24-3p基因相对表达量。本研究中所用引物序列见表1,miR-24-3p反向引物使用miRNA荧光定量试剂盒自带反向通用引物1.2.4CCK-8检测细胞增殖能力实验分为4组(mimicsNC,miR-24-3pmimics,inhibi-torNC,miR-24-3pinhibitor)。M G-6 3细胞转染48 小时后,收集各组细胞用完全培养基制成细胞悬液,各组细胞密度均为2 10 4个/mL。选择96 孔细胞培养板,细胞混匀后3355:
16、MODERNONCO31,No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学每孔加人细胞悬液10 0 L。放人37,5%的COz培养箱中孵育,细胞铺板时按2 4h、48 h、7 2 h 分组,每组设5个平行重复。在2 4h、48 h、7 2 h 时每孔加人CCK-8检测试剂10 L,37,5%的C0z培养箱中孵育2 小时,酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光度值并绘制细胞增殖曲线。EdU检测细胞增殖能力:实验分为4组(mimicsNC,miR-24-3pmimics,inhibitor NC,miR-24-3p inhibitor)。M G-6 3细胞转染48 小时后,收集各组细
17、胞用完全培养基制成细胞悬液,各组细胞密度均为2 10 4个/mL。选择96 孔细胞培养板,每孔加人细胞悬液10 0 L,每组设置5个副孔。次日待细胞贴壁后,以半换液的方式加人2 EdU孵育工作液,细胞培养箱中孵育2 小时后PBS洗涤3遍,每次5min。每孔加入10 0L4%多聚甲醛固定2 0 minPBS洗涤后加人通透剂,通透15min后PBS洗涤。配置EdU点击反应液,每孔加入10 0LEdU点击反应液后室温避光孵育30 min,PBS洗涤3次,每次5min。每孔加人10 0 L1:800稀释的Hoechst33342染色液避光孵育5min,进行细胞核染色,PBS洗涤3遍,每次5min,在荧
18、光显微镜下拍照并整理数据。表1miR-24-3p与U6引物序列Tab.1Primers sequence of miR-24-3p and U6GeneSequence(5-3)miR-24-3p-Forward primer5-GGTGGCTCAGTTCAGCAGGAAC-3U6-Forward primer5-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3U6-Reverse primer5-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-31.2.5Transwell检测细胞侵袭能力实验分为4组(mimics NC,miR-24-3p mimics,inhibi-torNC,miR-24-3pi
19、nhibitor)。M G-6 3细胞转染48 小时后。细胞计数后将各组细胞配成510 5个/mL的细胞悬液。每孔加人10 0 L细胞悬液。下室中加人7 0 0 L含有30%FBS条件培养基;37 培养箱中,孵育2 4h。取出Tran-swell小室用PBS洗3遍,用棉签擦去上室内未穿过的细胞和Matrigel基质胶,4%戊二醛固定30 min,自然风干小室。加入0.1%结晶紫染液7 0 0 L,室温染色40 min,PBS洗2 遍,显微镜下观察染色情况,显微镜随机取5个视野(10 0)进行细胞计数。1.2.6划痕实验检测细胞迁移能力实验分为4组(mimicsNC,miR-24-3pmimic
20、s,inhibi-torNC,miR-24-3pinhibitor)。M G-6 3细胞转染48 小时后,选择6 孔细胞培养板,取MG-63各组细胞制成细胞悬液,密度510 个/mL,细胞接种于6 孔板中,每孔加人细胞悬液2 mL,置于37,含5%的CO,的培养箱中培养。观察细胞完全贴壁融合率达到90%时,用2 0 0 L枪头沿marker横线垂直做划痕。用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加人无血清培养基,每组细胞在0 h,24h选择三个视野取样拍照记录实验结果1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡实验分为4组(mimics NC,miR-24-3p mimics,inhibi-tor NC,mi
21、R-24-3p inhibitor)。M G-6 3细胞转染48 小时后,将5BindingBuffer稀释为1BindingBuffe工作液备用。收集各组细胞,量约1 10 10 5个,用PBS重悬、洗涤细胞并常温下离心,随后在细胞沉淀中加入预先备好的1BindingBuffer500uL,用枪头轻轻吹打制成细胞悬液,然后每管加人ANNEXINV-FITC5L和PI10L。轻柔涡旋混匀后室温避光孵育5min,上机进行流式细胞检测并分析各组细胞调亡率。1.2.8Westernblotting检测PCNA蛋白表达实验分为4组(mimicsNC,miR-24-3p mimics,inhibi-to
22、rNC,miR-24-3pinhibitor)。M G-6 3细胞转染48 小时后,用PBS洗涤两遍,胰酶消化各组细胞后离心,细胞沉淀中加人RIPA强裂解液,超声破碎后裂解2 0 min,然后离心、吸取上清液即为提取的全蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度,根据测得蛋白浓度及体积,按4:1体积加入LoadingBuffer旋涡震荡混匀,在金属浴95煮5分钟,使蛋白质充分变性。在预制胶上样孔加人蛋白marker3L,蛋白样品30 g。常温条件下,恒压16 0 V,电泳缓冲液电泳40min左右,依次在转膜夹上将海绵、滤纸铺好,PVDF膜平铺在凝胶上,将转膜夹放人电转仪中进行横流转膜(30 0
23、 mA,60min)。5%的脱脂奶粉常温封闭12 0 min,加人1:30 0 0 稀释的PCNA一抗,4摇床上孵育过夜。常温下TBST洗膜3次,每次5min,洗膜完成后加人荧光二抗(1:8 0 0 0),避光常温下摇床上孵育40 min,收集荧光二抗,避光常温下TBST洗膜3次,每次10 min,洗膜完成后LI-COR曝光成像。1.3统计学分析所有数据使用SPSS23.0和GraphPadPrism8进行分析,数据以均数标准差表示。使用配对资料t检验分析骨肉瘤组织和癌旁组织中miR-24-3p表达。两组均数比较采用独立样本t检验进行分析。P0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1miR-2
24、4肉瘤细经中表达下调以正常骨为对照组,使用GEO2R在线分析细胞系中miRNA表达水平,以P 2 且P0.05为条件筛选,结果显示表达上调的miRNAs共8 5个,表达下调的miRNAs共8 5个,与正常骨组织相比,骨肉瘤细胞系中miR-24-3p表达降低GSE28423:OScell linesvsNormalHumanBone15(eneAd)o18o1-105Padj0.05downob up-15-10-505log2(foldchange)图1火山图显示CSE28423中表达上调及下调的miRNAsFig.1Volcano diagram showing up-regulated a
25、nd down-regulatedmiRNAsinGSE284232.2miR-24-3p在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞系中表达下调RT-qPCR结果显示,与癌旁正常组织相比,骨肉瘤组织中miR-24-3p表达显著下调(P0.01)(图2 A)。与hFOB1.19相比,骨肉瘤细胞系中miR-24-3p表达同样下3356miR-24-3p在骨肉瘤中的表达及其抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭迁移的实验研究万宁军,等调,其中以MG-63下调最明显,因此选择MG-63细胞系进行后续细胞功能实验(P0.001)(图2 B)。AB8*1.261.00.840.6*0.4*2*0.200.0AdjacentTumourn
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