SMF2和T39代谢产物对国槐根茎腐烂病致病镰刀菌的抑菌活性.pdf
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1、第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.4Aug.2023SMF2和T39代谢产物对国槐根茎腐烂病致病镰刀菌的抑菌活性赵晓彤,王桂清*(聊城大学农学与农业工程学院,山东 聊城 252000)摘要:【目的】研究长枝木霉SMF2和哈茨木霉T39的不同培养液和培养时间的代谢产物和不同有机溶剂的萃取物对镰刀菌的抑菌活性,明确SMF2和T39抑菌活性物质的培养条件和提取方法。【方法】以引起国槐根茎腐烂病的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solan
2、i)、多隔镰刀菌(F.decemcellulare)、木贼镰刀菌(F.equiseti)和F.keratoplasticum为靶标,采用菌丝生长速率法测定抑制率及毒力。【结果】SMF2和T39的PD培养液对尖孢镰刀菌的抑制作用最强;以WBM为营养基质、培养5 d的SMF2培养液,以PD营养基质、培养7 d的T39培养液,抑菌效果最优;正丁醇为SMF2和T39的抑菌活性物质的最佳提取溶剂,分步提取法正丁醇提取物对尖孢镰刀菌的抑菌效果良好,EC50仅为187.39和193.60 mg/L。【结论】SMF2和T39对镰刀菌具有较强的抑制效果;优化了木霉抑菌活性物质的营养条件和培养时间。关键词:长枝木
3、霉SMF2;哈茨木霉T39;镰刀菌;培养液;抑菌活性中图分类号:S476.1 文献标志码:A 文章编号:1000-2650(2023)04-0658-07Bacteriostatic Activity of Metabolites SMF2 and T39 against Pathogenic Fusarium of Root Rot Disease on Sophora japonicaZHAO Xiaotong,WANG Guiqing*(Agricultural Science and Engineering School,Liaocheng University,Liaocheng 2
4、52000,Shandong,China)Abstract:【Objective】This paper was conducted to study the antibacterial activities of metabolites of different culture media and incubation times of Trichoderma longibrachiatum SMF2 and T.harzianum T39 and extracts of different organic solvents on Fusarium,and to clarify the cul
5、ture conditions and extraction methods of SMF2 and T39 bacteriostatic active substances.【Method】Fusarium oxysporum,F.Solani,F.decemcellulare,F.equiseti and F.Keratomoplasticum,which caused root rot disease on Sophora japonica Linn were used as the test target,and the inhibition rate and virulence we
6、re determined by mycelial growth rate method.【Result】The results showed that the PD culture medium of SMF2 and T39 had the strongest inhibitory effect against F.oxysporum.SMF2 culture medium with WBM as nutrient matrix cultured for 5 days,and T39 culture medium with PD nutrient matrix cultured for 7
7、 days had the best bacteriostatic effect.N-butanol was the best extraction solvent of the bacteriostatic active substances of SMF2 and T39,and the step-by-step extraction N-butanol extract has a good antibacterial effect against F.oxysporum,and the EC50 was only 187.39 and 193.60 mg/L.【Conclusion】SM
8、F2 and T39 have strong inhibitory effects on Fusarium.The nutritional conditions and incubation time of Trichoderma bacteriostatic active were optimized.Keywords:Trichoderma longibrachiatum SMF2;T.harzianum T39;Fusarium;culture medium;bacteriostatic activitydoi:10.16036/j.issn.1000-2650.202305239收稿日
9、期:2023-01-09基金项目:国家自然科学基金项目(32001929);山东省自然科学基金项目(ZR2020MC125)。作者简介:赵晓彤,硕士研究生,E-mail:。*责任作者:王桂清,博士,教授,主要从事植物保护教学与科研,E-mail:。第 4 期赵晓彤,等:SMF2和T39代谢产物对国槐根茎腐烂病致病镰刀菌的抑菌活性木霉(Trichoderma)因具有广泛适应性、产生拮抗物质的多样性和寄生的广谱性而被认为是最有希望的生防因子1,木霉属真菌的某些种和菌株对镰刀菌具有较强的抗生活性因而可用作生物防治的有益微生物2,哈茨木霉(T.harzianum)和长枝木霉(T.longibrachi
10、atum)是最为常见的木霉菌3-4。木霉菌的生防机制多样,最重要的为抗生作用5-6,能够产生180种以上的抗生性次级代谢产物,例如木霉毒素、胶霉毒素和康宁霉素7等,从而对植物病原物具有拮抗作用8。镰刀菌(Fusarium)为真菌中较大的一个类群,现已报道的种类超500种,多为植物致病菌,引起番茄、大豆、西瓜、大蒜和国槐等植物病害有些镰刀菌还可以产生真菌毒素,严重危害人畜健康9-11。王桂清等12研究表明尖孢镰刀菌(F.oxysporum)等5种镰刀菌为国槐根茎腐烂病的致病菌,该病主要危害国槐枝干,造成皮层纵向开裂、溃烂,进而树势衰弱,最后导致枝干或整株死亡。哈茨木霉是目前农业生物防治中最具商业
11、化价值的木霉菌,应用广泛;长枝木霉是较为常见的拮抗类木霉,在植病生防中越来越受到重视。本研究以长枝木霉SMF2和哈茨木霉T39为研究对象,以引起国槐根茎腐烂病的5种镰刀菌为靶标菌,通过比较SMF2和T39不同培养液、不同培养时间、不同有机溶剂和不同提取方法得到的代谢产物对镰刀菌的抑菌活性,明确SMF2和T39次生代谢产物的最佳培养条件及对病原菌的抑菌效果,为日后深入研究木霉活性代谢产物的提取条件提供参考,也为研制开发生防木霉制剂和先导化合物提供基础理论依据。1材料和方法1.1试验材料供试菌种:供试木霉为长枝木霉(T.longibrachiatum)SMF2、哈茨木霉(T.harzianum)T
12、39。供试病原菌为引起国槐根茎腐烂病的5种主要致病菌镰刀菌:尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、多隔镰刀菌(F.decemcellulare)、木贼镰刀菌(F.equiseti)和F.keratoplasticum,均由聊城大学植物病理实验室提供。供试培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g和蒸馏水1 L;马铃薯葡萄糖培养液(PD):去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g和蒸馏水1 L;察氏培养液(CD):葡萄糖 20 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.6 g、MgSO47H2O 0.5 g、Na
13、Cl 0.1 g、天门冬酰胺5 g、CaCl2 0.1 g和蒸馏水1 L;麦麸培养液(WBM):麦麸皮40 g、去皮马铃薯 50 g、蔗糖 20 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO47H2O 0.5 g、CaCl2 0.25 g和蒸馏水1 L;燕麦培养液(OM):燕麦片 40 g 和蒸馏水 1 L;麦芽糖培养液(ME):麦芽糖20 g和蒸馏水1 L13。上述培养基及5种培养液121 15 min高温灭菌备用。供试有机溶剂:按极性由小到大排列为石油醚(天津市大茂化学试剂厂)、四氯化碳(天津市风船化学试剂科技有限公司)、正丁醇(天津市化学试剂三厂)、乙酸乙酯(烟台远东精细化工有限公司)和三氯甲
14、烷(烟台市双双化工有限公司),均为分析纯。1.2试验方法1.2.1SMF2和T39菌株的活化将斜面上保存的长枝木霉 SMF2 和哈茨木霉T39于PDA培养基上活化,(251)恒温培养箱培养5 d,保存备用。1.2.2代表性镰刀菌的确定取已活化的SMF2和T39,打取菌饼(0.7 cm),分别装入盛有100 mL PD培养液的三角瓶中,1瓶15饼,3次重复,于(251)、180 r/min振荡培养7 d。所得培养液经0.22 m无菌滤膜过滤后,与PDA培养基混匀制成含毒培养基,使滤液终浓度为总体积的60%,以不加滤液的PDA培养基作为对照14。分别接种 5 种镰刀菌菌饼,一皿一饼,3 次重复,于
15、(251)恒温培养箱中培养5 d,观察生长状态,测量菌落直径,计算抑制率。1.2.3最适培养液的筛选配制PD、CD、WBM、OM和ME培养液,分别装入三角瓶,每瓶100 mL,接种SMF2和T39菌饼,1瓶15饼,3次重复,培养条件同上。采用1.2.2中方法,制备含次生代谢产物的含毒培养基,接种1.2.2确定的代谢性镰刀菌(尖孢镰刀菌),培养5 d,测量菌落直径,计算抑制率。1.2.4最佳培养时间的筛选选用1.2.3确定的最适培养液(PD),接种SMF2和T39菌饼,(251)、180 r/min分别振荡培养1、2、3、5、7、9和11 d,采用1.2.2中方法,制备含毒培养基,接种1.2.2
16、确定的代谢性镰刀菌(尖孢镰刀菌),培养5 d,测量菌落直径,计算抑制率。1.2.5最适提取溶剂及提取方法的筛选平行提取法:配制 1.2.3 确定的最适培养液659四川农业大学学报第 41 卷(PD),分别接种 SMF2 和 T39 菌饼,震荡培养 6 d,得到含次生代谢产物的滤液。滤液用供试的5种有机溶剂分别萃取,按滤液有机溶剂=1 3(V/V)比例浸提3次,分别收集有机相和水相,经旋转蒸发直至冷凝管中无溶液滴下,分别得到含 SMF2和T39次生代谢产物的10种提取物原液,制成含毒 PDA 培养基,接种代谢性镰刀菌(尖孢镰刀菌),以添加无菌水的PDA作为对照。3次重复,于(251)恒温培养箱中
17、培养5 d,观察镰刀菌的生长状态,测量菌落直径,计算抑制率和半最大效应浓度EC50。分步提取法:含SMF2和T39次生代谢产物的PD滤液,用供试5种有机溶剂依极性从小到大连续萃取,首先按滤液:石油醚等比例浸提3次,移出有机层,水层进行下一步萃取,溶剂分别为正丁醇,乙酸乙酯、三氯甲烷和四氯化碳,保留最后的水层。浓缩各提取液,分别得到含SMF2、T39次生代谢产物的6种提取物原液,接种代谢性镰刀菌(尖孢镰刀菌),计算抑制率和EC50。药液浓度的配制:先将不同溶剂提取原液用少许乙醇(不超过终体积的2%)充分溶解,采用二倍稀释法用无菌水配制成5个浓度梯度,终浓度分别为62.5、125、250、500和
18、1 000 mg/L。1.3项目测定1.3.1抑菌活性的测定以生长速率法测定不同溶剂提取物对病原菌菌丝生长的抑制作用。采用十字交叉法测量不同处理组和对照组镰刀菌菌落生长直径,根据下式计算抑制率15:抑制率/%=对照组菌落直径(cm)-处理组菌落直径(cm)对照组菌落直径()cm-0.7(cm)1001.3.2抑菌毒力回归线的建立取不同溶剂提取物适当量,加入一定量的乙醇使之完全溶解,用无菌水按等比设计稀释成系列浓度。试验重复3次,建立毒力回归方程。将抑制率转换成概率值,浓度转换成对数,进行概率值分析求出各提取物对病原菌的抑制中浓度(EC50)。1.4数据分析利用Microsoft Excel 2
19、020软件处理数据,采用DPS 19.05数据处理软件使用Duncan法进行方差分析及显著性检验,线性回归等由SPSS 26.0完成。2结果与分析2.1SMF2和T39的PD培养液对5种镰刀菌的抑菌活性SMF2和T39以PD培养液为基质的代谢产物对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、多隔镰刀菌、木贼镰刀菌和F.keratoplasticum5种镰刀菌均有一定的抑菌效果,同一木霉菌的PD培养液对5种镰刀菌的抑制率不同,SMF2和T39的PD培养液对同一镰刀菌的抑制率也不同(图12)。当培养液终浓度为含毒培养基总体积的60%时,SMF2的PD培养液对供试5种镰刀菌的抑制率分别为 11.53%、14.56%、1
20、6.72%、17.73%和20.10%;T39的PD培养液的抑制率分别为8.67%、11.79%、17.59%、19.26%和51.77%,且两者均对尖孢镰刀菌的抑菌效果最好,对多隔镰刀菌的效果最差。对于尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌而言,T39的PD培养液抑菌效果好于SMF2,对于腐皮镰刀菌、多隔镰刀菌和 F.keratoplasticum 而言,SMF2的PD培养液抑菌效果好于T39;两种木霉PD培养液对尖孢镰刀菌的抑菌效果差异极显著,T39(51.77%)是SMF2(20.10%)的2.58倍,但对其他镰刀菌抑菌效果差异不显著,供试浓度下抑菌率均小于20%。由于SMF2和T39以PD为营养基质的
21、代谢产物均对尖孢镰刀菌的抑菌效果最佳,由此,选择尖孢第一行为对照组,第二行为SMF2处理组,第三行为T39处理组。从左至右依次为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、多隔镰刀菌、木贼镰刀菌和F.keratoplasticum。The first line was the CK group,the second line was T.longibrachiatum SMF2 treatment group,the third line was T.harzianum T39 treatment group.From left to right,F.oxysporum,F.Solani,F.decemcellu
22、lare,F.equiseti and F.Keratomoplasticum.图1SMF2和T39的PD培养液下镰刀菌菌落形态Figure 1Fusarium colony morphology under the PD culture medium of SMF2 and T39660第 4 期赵晓彤,等:SMF2和T39代谢产物对国槐根茎腐烂病致病镰刀菌的抑菌活性镰刀菌测定SMF2和T39代谢产物的抑菌活性。2.2SMF2和T39的5种培养液对尖孢镰刀菌的抑菌活性SMF2 和 T39 的 PD、CD、WBM、OM 和 ME 培养液代谢产物对尖孢镰刀菌的生长均具有抑制作用。尖孢镰刀菌在含S
23、MF2不同培养液代谢产物的培养基中的菌落大小依次为MEOMPDCDWBM,而在含T39的不同代谢产物培养基中的菌落直径依次为MEOMWBMCDPD(图3)。在供试浓度即培养液终浓度为含毒培养基总体积的60%下,SMF2的ME、OM、PD、CD和WBM不同培养液对尖孢镰刀菌的抑制率分别为 3.27%、8.54%、21.91%、31.90%和 39.12%,其中 WBM 培养液的抑菌效果最佳,而ME的抑制率仅为3.27%,前者是后者的11.96倍;T39的ME、OM、WBM、CD 和PD 不同培养液对尖孢镰刀菌的抑制率分别为8.64%、17.33%、18.29%、22.96%和45.55%,以PD
24、培养液的抑菌效果最为理想,以ME培养液的效果最差,前者是后者的5.27倍。比较同一营养条件下两种木霉代谢产物对尖孢镰刀菌的抑菌效果,可知,培养液分别为PD、CD、WBM、OM和ME时,SMF2的代谢产物对尖孢镰刀菌的抑制率是 T39 的 0.56、0.18、1.39、0.99 和 2.63倍,两者差异显著。研究结果说明,营养基质不同,SMF2和T39代谢产物不同,对尖孢镰刀菌的抑菌效果不同,PD、CD和WBM为较适宜营养基质(图4)。当营养基质为PD培养液时,T39的代谢产物对尖孢镰刀菌抑菌效果最优,同时SMF2的抑制率也较高,因此,选用PD培养液作为SMF2和T39的适宜营养基质测定木霉代谢
25、产物的抑菌活性。2.3SMF2和T39不同培养时间PD培养液对尖孢镰刀菌的抑菌活性SMF2和T39的PD培养液在不同培养时间下,与CK组相比,其代谢产物对尖孢镰刀菌的影响不同,均随着培养天数的增加,尖孢镰刀菌菌落直径呈现先减小后增大,即抑菌效果呈现先提高后降低的变化趋势(图56)。SMF2和T39抑菌代谢产物的最佳培养时间存在差异(图6)。在供试时间范围内,SMF2的PD培养液对尖孢镰刀菌的抑制率范围为4.03%51.72%,同色柱上不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异显著(P0.05),不同大写字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异显著(P0.01)。下同。Differen
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