miR-181b通过靶向PTEN调控缺血性脑卒中后血管新生的作用和机制研究.pdf
《miR-181b通过靶向PTEN调控缺血性脑卒中后血管新生的作用和机制研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《miR-181b通过靶向PTEN调控缺血性脑卒中后血管新生的作用和机制研究.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、Correspouxlman生物工程359.BME&ClinMed,May2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期网络出版时间:2 0 2 3-0 4-2 116:13:30 D0I:10.13339/j.c n k i s g l c.2 0 2 30 42 0.0 19网络出版地址:https:/ 5只,鼠龄1012周,体质量50 2 8 0 g。随机分为4组,即假手术组、模型组、miR-NC组和miR-181b组。除假手术组外,其他3组采用大脑中动脉线栓法建模,miR-NC组和miR-181b组大鼠分别尾静脉注射miR-NC及miR-181
2、b质粒。治疗2 周后,评价大鼠改良神经功能缺损评分(mNSS)。进行脑组织2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,免疫荧光检测脑组织簇分化抗原34(CD34)、血管内皮生长因子(VEGF)表达。对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)进行转染,分为Control组(正常培养)、miR-NC组(转染miR-NC空质粒)及miR-181b组(转染miR-181bmimics质粒)。CCK-8检测细胞增殖能力。划痕实验检测细胞迁移能力。成管实验检测成管能力。荧光素酶报告实验检测miR-181b与磷酸酯酶-张力蛋白同源物基因(PTEN)的靶向关系。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞、组织mi
3、R-181b表达水平。Westernblot检测细胞、组织中PTEN蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠mNSS、脑梗死面积升高(t=17.420,34.000,P0.05)。与miR-NC组比较,miR-181b组大鼠mNSS、脑梗死面积降低(t=14.730,21.160,P0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中miR-181b表达(0.140.0 2),CD34阳性细胞率(45.0 3%5.2 2%),VEGF阳性细胞率(2 5.0 6%5.11%),CD34、VEG F蛋白表达水平(0.2 50.0 6、0.2 10.0 4)下降,PTEN蛋白表达水平(0.930.0
4、5)升高(P0.05)。与miR-NC组比较,miR-181b组大鼠脑组织中miR-181b表达(3.0 2 0.45),CD34阳性细胞率(6 8.7 3%7.0 4%),VECF阳性细胞率(0.2 3%0.0 6%),CD34、V ECF蛋白表达水平(0.8 6 0.12、0.7 2 0.0 9)升高PTEN蛋白表达水平(0.37 0.02)下降(P0.05)。m iR-18 1b 组细胞miR-181b表达水平,细胞2 4h、48 h 及7 2 hOD值、迁移率,节段长度、分支长度、连接数和网孔数高于miR-NC组(P0.05)。m i R-18 1b 可负性调控PTEN表达。结论过表达
5、miR-181b可靶向PTEN改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,促进血管新生。关键词:miR-181b;人张力蛋白同源物基因(PTEN);缺血性脑卒中;血管新生中图分类号:R743.3文献标识码:A文章编号:10 0 9-7 0 9 0(2 0 2 3)0 3-0 359-0 8Effect and mechanism of miR-181b in regulating angiogenesis after ischemic stroke via targeting PTENZHANGYe,ZHUANG Xue-ming,WANG Jing,XU Hai-ting,WANG Zhong-xi
6、ang,WANG Shi-bo,ZHANG Li,TANG Guang-(Department of Emergency,the 904th Hospital of Joint Support Force of the Chinese Peoples Liberation Army,W214000,Jiangsu,China)nding author:TANG Guang-man.E-mail:.Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of miR-181b on angiogenesis after ischemi
7、c stroke.MethodsA total of 65 SPF grade male SD rats were sacrificed,with age of 10-12 weeks and body mass of 50-280 g.All of the ratswere randomly divided into 4 groups:sham group,model group,miR-NC group and miR-181b group.Except control group,other three groups were modeled by middle cerebral art
8、ery occlusion method,the rats in miR-NC group and miR-181b groupwere injected with miR-NC and miR-181b plasmid through tail vein,respectively.After treatment for 2 weeks,the modifiedneurological severity score(mNSS)was evaluated.The expression of cluster differentiation antigen 34(CD34)and vascular
9、en-dothelial growth factor(VEGF)in brain tissue was detected by immunofluorescence.The human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)were transfected and divided into control group(normal culture),miR-NC group(transfected miR-NC empty plasmid)and miR-181b group(transfected miR-181b mimics plasmid).The
10、 cell proliferation ability was detected by cell counting kit-8(CCK-8)assay;cell migration ability was detected by scratch assay;tube formation assay was used to detect tube formationaility;the targeting relationship between miR-181b and human tensin homologue gene(PTEN)was detected by luciferase re
11、-porter assay;quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect expression level ofmiR-181b in cells and tissues;Western blot was used to detect expression levels of PTEN,CD34 and VEGF protein in cells and作者单位:中国人民解放军联勤保障部队第九四医院急诊科,江苏无锡2 140 0 0作者简介:张烨(198 4一),
12、男,江苏徐州市人,本科,主治医师,主要从事急诊脑卒中、胸痛中心和外周血管手术治疗工作。电话:0 510-8 5142 16 0。E-mail:。基金项目:无锡市卫生健康委员会科研项目(Z201909)通信作者:唐广满(198 5),男,山东泰安市人,研究生,主治医师,主要从事脊柱侧弯治疗工作。电话:158 52 50 6 96 3。E-mail:40 9536 37 0 q q.c o m。版权保护,不得翻录。360-BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期tissues.Resultss Compared wi
13、th sham group,mNSS and cerebral infarction area of model group were increased(t=17.420,34.000,P 0.05).Compared with miR-NC group,mNSS and cerebral infarction area in miR-181b group were decreased(t=14.730,21.160,P 0.05).Compared with sham group,the expression of miR-181b(0.14 0.02),CD34 positive rat
14、e(45.03%5.22%),VEGF positive rate(25.06%5.11%),CD34 and VEGF protein expression levels(0.25 0.06,0.21 0.04)in braintissue of model group were decreased,and PTEN protein expression level(0.93 0.05)increased(P 0.05).Compared with miR-NC group,miR-181b expression(3.02 0.45),CD34 positive rate(68.73%7.0
15、4%),VEGF positive rate(0.23%0.06%),CD34 and VECF protein expression levels(0.86 0.12,0.72 0.09)in brain tissue of miR-181b group were increased,whilePTEN protein expression level(0.37 0.02)decreased(P 0.05).MiR-181b negatively regulated PTEN expression.The expres-sion level of miR-181b,optical densi
16、ty(OD)value,migration rate,segment length,branch length,connection number and meshesof cells at 24-hour,48-hour and 72-hour in miR-181b group were higher than those in miR-NC group(P 0.05).The miR-181b negatively regulated PTEN expression.Conclusion It is demonstrated that overexpression of miR-181b
17、 could target PTENto improve neural function and promote vascularization in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Key words:miR-181b;human tensin homologue gene;ischemic stroke;vascular neurogenesis缺血性脑卒中是脑血管疾病常见类型,也是老年人死亡的常见病因,主要病理为脑血管灌注不足,导致脑组织局部缺血、坏死,进而出现神经功能障碍。在脑动脉阻塞后,脑梗死恢复区的血管内皮细胞增殖,形成
18、新生血管,保护神经细胞。因此,如何促进血管新生成为缺血性脑卒中治疗的关键点。微小RNA(mircoRNA,miRNAs)是一类非编码RNA,在调控细胞各种生物学功能中发挥重要作用。最近研究发现,miRNAs在调控脑梗死血管新生中扮演着重要角色2 4。miR-181b是最近发现的一种miRNA,在调控肿瘤、心脑血管疾病中发挥作用5,6 。葛丽等7 研究发现,miR-181b在动脉粥样硬化血管内皮细胞中低表达,上调miR-181b可抑制细胞调亡、促进细胞增殖。但miR-181b与缺血性脑卒中后血管新生的关系尚不清楚。人张力蛋白同源物基因(phosphate and tensionhomology
19、deleted on chromosome 10,PTEN)是一种与侵袭和血管生成过程有关的致癌基因,上调PTEN可抑制多种疾病的血管生成8 10 。研究发现,miR-21-5p可通过PTEN/肌醇磷脂-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threoninek-inase,AKT)通路调控脑梗死后血管内皮细胞功能叫但miR-181b是否亦能调控PTEN影响血管新生尚不清楚。笔者研究通过构建大鼠脑缺血模型,观察miR-181b对大鼠脑组织血管生成的影响,并通过体外实验探讨miR-181b对血管内皮细胞增殖、迁移的影响
20、及可能机制1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物65只SPF级雄性SD大鼠,鼠龄10 12 周,体质量50 2 8 0 g。购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司,动物许可证号SCXK(苏)2 0 18-0 0 0 8。动物饲养于无锡恒泰实验动物养殖有限公司,昼夜交替12h,温度2 4,湿度45%。动物实验经中国人民解放军联勤保障部队第九四医院伦理委员会批准(20220012)。1.1.2细胞与主要试剂人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical veinendothelialcells,H U VEC)(上海弘顺生物科技有限公司,中国)。达氏修正伊氏培养液/营养混合(Dulbec
21、cosmodified Eagles medium/nutrient mixture F-12,DMEM/F-12)、胰酶及青霉素/链霉素(上海如吉生物科技发展有限公司,中国);miR-NC质粒、miR-181bmimics质粒、野生型(wildtype,W T)-PT EN载体、突变型(mutant,MUT)-PTEN载体及聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEC)包备的脂质体(北京擎科生物有限公司,中国);Lipofectamine 2000,CCK-8(c e l l c o u n t i n g k i t-8)试剂盒及Matrigel胶(武汉卡诺斯科技有限公司,中国)
22、;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenylte-trazoliumchloride,TTC)试剂(武汉华翔科洁生物技术有限公司,中国);荧光素酶报告试剂盒(艾美捷科技有限公司,中国);Mir-XmiRNAFirst-StrandSynthesisKit(TAKARA生物有限公司,日本);兔抗鼠簇分化抗原34(clusterofdifferentiation34,CD34)、山羊抗鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、兔抗鼠磷酸酯酶-张力蛋白同源物(phos-phatase and tensin homolog,
23、PTEN)、二抗(北京普鲁顿生物科技有限公司,中国);异硫氰酸荧光素(fluores-cein isothiocyanate,FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的二抗及4,6-二基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino 2-phenylindole,DAPI)(北京中杉金桥生物有限公司,中国)。1.1.3仪器酶标仪(南京贝灯医疗器械有限公司,中国);聚361生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期BME&Clin Med,May2023,Vol.27,No.3合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(A BI公司
24、,美国);ZEISSAxioZoom.V16蔡司荧光显微镜(蔡司,德国)。1.2方法1.2.1动物实验1.2.1.1动物模型制备与分组随机将6 5只大鼠分为假手术组15只,其余50 只大鼠进行建模。50 只大鼠成功建模45只,成功率90%。将45只建模成功的大鼠随机分为模型组、miR-NC组及miR-181b组,每组15只。使用大脑中动脉线栓法进行大鼠脑缺血再灌注模型的制备。具体步骤如下:将SD大鼠采用乙醚麻醉后,放置于操作台上,消毒;解剖出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉;在颈内、外动脉交汇处用丝线将颈内动脉挂线阻塞,2 h后解除丝线;等待大鼠清醒后采用Zea-Longa神经功能评分法判断建
25、模的成功与否(评分2 分提示建模成功,2 分提示建模失败)。1.2.1.2大鼠治疗方法假手术组大鼠暴露颈内、外动脉后不进行结扎,其他组处理与模型组大鼠一样。术后6 h对各组大鼠进行干预:miR-NC组大鼠给予尾静脉注射PEG-miR-NC(2mg/kg,1次/天);miR-181b组大鼠给予尾静脉注射PEG-miR-181b(2mg/kg,1次/天);模型组、假手术组大鼠给予尾静脉注射PEG包备的空载脂质体(2 mg/kg,1次/天)。所有大鼠治疗2周后进行后续实验1.2.1.3大鼠改良神经功能缺损评分分别于治疗前、治疗后14d,对大鼠进行大鼠改良神经功能缺损评分(modified neuro
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- miR 181 通过 靶向 PTEN 调控 缺血性 脑卒中 血管 新生 作用 机制 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。