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病毒样颗粒自组装与解组装的动力学研究.pdf
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1、第6 2卷 第5期厦门大学学报(自然科学版)V o l.6 2 N o.5 2 0 2 3年9月J o u r n a l o fX i a m e nU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)S e p.2 0 2 3 h t t p:j x m u.x m u.e d u.c nd o i:1 0.6 0 4 3/j.i s s n.0 4 3 8-0 4 7 9.2 0 2 2 0 4 0 3 3病毒样颗粒自组装与解组装的动力学研究高 远,邵先凯,陈玉清,杨柳林*(厦门大学化学化工学院,福建 厦门3 6 1 0 0 5)摘要:豇豆褪绿
2、斑驳病毒(c o w p e a c h l o r o t i cm o t t l ev i r u s,C C MV)的衣壳蛋白可自组装形成空心病毒样颗粒(v i r u s-l i k ep a r t i c l e s,V L P s),并应用于构筑纳米容器或纳米反应器.为了探究其自组装与解组装的动力学机制和时间尺度,利用荧光光谱结合动态激光光散射研究了C C MV衣壳蛋白在无模板分子诱导时的自组装与解组装的动力学过程,获得其动力学方程,并明确了自组装与解组装的时间尺度在分钟级别.C C MV衣壳蛋白在p H=4.7 0 5.3 1条件下5m i n内完成自组装,p H越低自组装速
3、度越快.自组装过程可分为两个阶段:第一阶段遵循二级反应动力学,生成二聚体蛋白的寡聚体;第二阶段满足成核生长动力学模型,寡聚体进一步组装形成V L P s前体,最终形成完整的C C MVV L P s.在p H=7.6 0 8.6 2条件下解组装的时间尺度介于5 1 0m i n之间,p H越高解组装速度越快.解组装过程中C C MVV L P s首先膨胀形成松散的组装结构,随后整体解散,满足二级反应动力学.对病毒衣壳蛋白自组装过程的深入了解有助于人们在时空间尺度精准调控其纳米容器和纳米反应器的构筑及功能.关键词:病毒样颗粒;自组装;解组装;动力学中图分类号:O6 4 1 文献标志码:A 文章编
4、号:0 4 3 8-0 4 7 9(2 0 2 3)0 5-0 8 3 3-0 9收稿日期:2 0 2 2-0 4-1 9 录用日期:2 0 2 2-0 7-0 6 基金项目:国家自然科学基金(2 1 9 7 1 2 1 6);中央高校基本科研业务费(2 0 7 2 0 2 1 0 0 0 7)*通信作者:l l y a n g x m u.e d u.c n引文格式:高远,邵先凯,陈玉清,等.病毒样颗粒自组装与解组装的动力学研究J.厦门大学学报(自然科学版),2 0 2 3,6 2(5):8 3 3-8 4 1.C i t a t i o n:G A OY,S HA OXK,C H E N
5、Y Q,e ta l.K i n e t i cs t u d yo fs e l f-a s s e m b l ya n dd i s a s s e m b l yo fv i r u s-l i k ep a r t i c l e sJ.JX i a m e nU n i vN a t S c i,2 0 2 3,6 2(5):8 3 3-8 4 1.(i nC h i n e s e)病毒样颗粒(v i r u s-l i k ep a r t i c l e s,V L P s)是由病毒衣壳蛋白自组装形成的类似病毒的空心颗粒,具有精准可控的结构和高度均一的尺寸.V P L s可作
6、为纳米容器与纳米反应器应用于催化、药物递送、疫苗等领域而备受关注1-5.研究病毒衣壳蛋白的自组装机制与组装动力学,不仅可加深对分子组装的基本原理与规律的认识,同时也有助于开发各种功能纳米材料6-1 0.豇豆 褪 绿 斑 驳 病 毒(c o w p e ac h l o r o t i c m o t t l ev i r u s,C C MV)是一种单链R N A植物病毒,衣壳为外径2 8n m的二十面体结构,由1 8 0个相同的蛋白单体形成的1 2个五聚体和2 0个六聚体亚基簇组成1 1-1 3.C C MV衣壳蛋白具有可逆的自组装与解组装的性质.如图1所示,在弱碱(p H=7.5)高盐浓度
7、(1m o l/LN a C l)环境下,C C MV解组装形成游离的衣壳蛋白二聚体(c a p s i dp r o t e i nd i m e r,C P D)和R N A.单纯的衣壳蛋白二聚体在弱酸性(p H7.7)条件下,未能观察到C C MV V L P s的膨胀,而是直接解组装,这可能是由于此时氨基端的精氨酸残基高度去质子化,极大地削弱了蛋白质间的相互作用力,导致组装体迅速解离.C C MVV L P s解组装过程的时间尺度具有p H响应性,如表3所示,在不同p H条件下(p H 7.0),5 1 3m i n后C C MVV L P s平均粒径从2 8n m变成7n m左右,表
8、明已解组装成C P D;在p H=7.6 08.6 2条件下解组装时间介于51 0m i n之间.总体而言,p H值越高,解组装的速率越快.在p H=8.6 2时,由于解组装速率过快,已无法通过D L S监测其粒径变化过程.表3 C C MVV L P s在不同p H下解组装过程的平均粒径变化T a b.3 T h e c h a n g e so f a v e r a g ep a r t i c l e s i z e so fC C MVV L P so v e r t i m ed u r i n gd i s a s s e m b l yp r o c e s s a t d i
9、 f f e r e n t p Hp H平均粒径/n mP D I时间/s7.1 23 2.0 1 1.9 80.6 62 6 02 9.9 7 3.1 30.6 84 2 81 0.4 7 1.0 10.6 75 9 47.4 6 0.3 10.4 67 8 77.4 62 5.6 6 2.3 90.4 42 6 52 7.1 9 2.7 20.3 73 6 77.9 6 0.6 00.6 56 3 67.6 02 5.8 2 1.7 40.6 42 0 82 7.8 9 1.7 60.6 13 9 77.1 3 0.4 90.4 75 5 67.7 32 5.6 9 4.9 40.5 7
10、2 4 49.8 6 2.3 30.5 73 8 38.0 82 7.4 3 1.5 40.5 12 2 96.6 8 0.5 50.4 73 8 08.6 24.9 5 0.2 70.6 72 6 4 为了提高解组装动力学监测的时间分辨率,进一步利用荧光光谱原位追踪C C MVV L P s解组装过程.如图6所示,在不同p H下,随着解组装的进行,溶液的荧光强度先是快速增强,而后逐渐趋于恒定.这是由于解组装对应于C P D的解聚集,荧光标记物F I T C的荧光获得恢复;其时间尺度为5 1 0m i n,与D L S监测数据一致.荧光强度稳定后的样品经D L S检测表明颗粒粒径约为7n m,
11、表明C C MVV L P s已解组装成C P D.荧光检测表明,较高的p H有利于解组装的进行.同时对C C MVV L P s解组装的荧光动力学数据进行拟合,结果如图6所示.图6 C C MVV L P s-F I T C在不同p H下解组装过程中荧光强度随时间的变化(散点)及动力学拟合曲线(实线)F i g.6 T h e c h a n g e so f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y(s p o t s)o fC C MVV L P s-F I T Co v e r t i m e a n dk i n e t i c f i t
12、t i n gc u r v e s(l i n e s)d u r i n gd i s a s s e m b l yp r o c e s s a t d i f f e r e n t p H其解组装过程符合二级反应动力学,公式为:F=A2k2t+B2,其中,k2为解组装过程的二级反应动力学常数,A2和B2为常数.拟合得到的相关系数如表4所示.838第5期高 远等:病毒样颗粒自组装与解组装的动力学研究h t t p:j x m u.x m u.e d u.c n表4 C C MVV L P s-F I T C解组装动力学拟合方程的相关系数T a b.4 T h e c o r r e
13、l a t i o nc o e f f i c i e n t so fC C MVV L P s-F I T Cd i s a s s e m b l yk i n e t i c f i t t i n ge q u a t i o n sp HA2/(1 03Lg-1)B2/(1 0-4Lg-1)k2/(1 0-6Lg-1s-1)R27.4 51 0.6 52.9 1 11.9 7 60.9 9 47.7 58.4 4 03.7 1 94.4 7 00.9 9 38.0 56.8 9 94.3 6 86.9 3 50.9 9 3由图6可见,拟合数据与实测数据匹配良好.注意到,C C M
14、VV L P s解组装的荧光动力学曲线与自组装的荧光动力学曲线(图5)并不对应,这表明C C MVV L P s的解组装过程并非自组装的逆过程.根据荧光光谱的监测数据和D L S的数据,认为C C MVV L P s解组装过程为整体解组装,即从C C MVV L P s直接解组装成C P D.2.5 C P D自组装与C C M VV L P s解组装的路径依据动力学数据可推测C P D的自组装路径(图7红箭头)以及C C MVV L P s的解组装路径(图7蓝箭头).在C P D自组装过程的荧光光谱监测中观测到两个明显的阶段.过往的研究尽管也有提及该现象,但是只是简单地将两阶段分别归属于成核
15、阶段与生长阶段.深入分析测得的动力学数据后认为该划分并不准确.具体而言,C P D首先快速组装形成寡聚体,该过程满足二级反应动力学,结合文献报道2 8-2 9,寡聚体很可能是C P D的五聚体和六聚体;随后寡聚体进一步组装形成V L P s前体,最后逐渐形成完整的C C MVV L P s,该过程才符合成核生长动力学模型.依据动力学数据,依次给出了组装过程各个阶段的时间尺度.尽管动力学时间受样品浓度、p H等条件的影响,仍可估算总体的组装时间尺度应在分钟级别.C C MVV L P s解组装的时间尺度约在51 3 m i n.C C MVV L P s在中性条件下先略有膨胀形成较为松散的组装体
16、结构,而后整体解离形成C P D;而在弱碱性条件下只观察到其直接解组装的过程.C C MVV L P s在中性条件下体积略有膨胀,是由于此时蛋白间的相互作用被削弱导致组装体结构变得较为松散,该膨胀现象在以核酸为模板诱导形成实心的C C MVV L P s中也有观察到.而在偏碱性的条件下,由于组装体结构的高度不稳定导致其迅速解组装,难以监测到膨胀现象.图7 C P D(4m g/m L)自组装路径(红箭头)与C C MVV L P s解组装路径(蓝箭头)F i g.7 T h e s e l f-a s s e m b l yp a t h w a y(r e da r r o w s)o fC
17、 P D(4m g/m L)a n d t h ed i s a s s e m b l yp a t h w a yo fC C MVV L P s(b l u e a r r o w s)3 结 论本文研究了C C MV衣壳蛋白的自组装和解组装的动力学,获得相关过程的时间尺度,并给出相应的动力学模型,提出了可能的自组装与解组装路径.C P D在弱酸性条件下自组装时间尺度在分钟级别,p H越低组装速率越快.与通常认为的成核生长过程有所不同,实验观察到C P D组装过程可分为两个阶段:第一阶段C P D快速形成寡聚体,符合二级动力学过程;第二阶段寡聚体组装形成V L P s前体后最终形成完整的
18、C C MVV L P s,该过程才符合成核生长动力学模型.C C MVV L P s在不同p H条件下解组装的时间也在分钟级别,p H值越高解组装越快.在近中性条件下,C C MV V L P s先略有膨胀而后整体解离形成C P D,在弱碱性条件下则快速解离形成C P D,解组装938厦门大学学报(自然科学版)2 0 2 3年h t t p:j x m u.x m u.e d u.c n过程符合二级反应动力学.上述结果回答了基于C C MV的V P L s的自组装与解组装的时间尺度问题,加深了人们对其动力学过程的了解,有助于在时空间尺度精准调控纳米容器及纳米反应器的构筑与功能.参考文献:1
19、C OM E L L A S-A R A G O N S M,D EL A E S C O S U R A A,D I R K SA TJ,e ta l.C o n t r o l l e di n t e g r a t i o no fp o l y m e r si n t ov i r a l c a p s i d sJ.B i o m a c r o m o l e c u l e s,2 0 0 9,1 0(1 1):3 1 4 1-3 1 4 7.2 KWA KM,M I N T E NI J,A N A Y ADM,e t a l.V i r u s-l i k ep a r
20、 t i c l e st e m p l a t e db yD N A m i c e l l e s:ag e n e r a lm e t h o df o r l o a d i n gv i r u s n a n o c a r r i e r sJ.J o u r n a l o f t h eA m e r i c a nC h e m i c a l S o c i e t y,2 0 1 0,1 3 2(2 3):7 8 3 4-7 8 3 5.3 L I L J E S T R M V,M I K K I L J,K O S T I A I N E N M A.S e
21、l f-a s s e m b l ya n d m o d u l a rf u n c t i o n a l i z a t i o n o ft h r e e-d i m e n s i o n a l c r y s t a l s f r o mo p p o s i t e l y c h a r g e dp r o t e i n sJ.N a t u r eC o m m u n i c a t i o n s,2 0 1 4,5:4 4 4 5.4 B R I L L A U L T L,J U T R A S P V,D A S H T I N,e ta l.E n
22、g i n e e r i n gr e c o m b i n a n tv i r u s-l i k e n a n o p a r t i c l e sf r o mp l a n t s f o rc e l l u l a rd e l i v e r yJ.A C SN a n o,2 0 1 7,1 1(4):3 4 7 6-3 4 8 4.5 S C HO O N E NL,MA A S S E NS,N O L T E RJM,e ta l.S t a b i l i z a t i o no f a v i r u s-l i k e p a r t i c l e a
23、 n d i t s a p p l i c a t i o n a s an a n o r e a c t o ra tp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n sJ.B i o m a c r o-m o l e c u l e s,2 0 1 7,1 8(1 1):3 4 9 2-3 4 9 7.6 P A T T E R S O NDP,S C HWA R ZB,WA T E R SRS,e t a l.E n c a p s u l a t i o no f a n e n z y m e c a s c a d ew i t h i n
24、 t h eb a c t e r i o p h a g eP 2 2v i r u s-l i k ep a r t i c l eJ.A C SC h e m i c a lB i o l o g y,2 0 1 4,9(2):3 5 9-3 6 5.7 R O O SW H,B R U I N S MA R,WU I T E GJL.P h y s i c a lv i r o l o g yJ.N a t u r eP h y s i c s,2 0 1 0,6(1 0):7 3 3-7 4 3.8 P A T T E R S O NDP,P R E V E L I G EPE,D
25、O U G L A ST.N a n o r e a c t o r s b yp r o g r a m m e d e n z y m e e n c a p s u l a t i o n i n s i d et h e c a p s i do f t h eb a c t e r i o p h a g eP 2 2J.A C SN a n o,2 0 1 2,6(6):5 0 0 0-5 0 0 9.9 T I MM E RMA N S S B P E,V E R V O O R T D F M,S C HO O N E NL,e ta l.S e l f-a s s e m b
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