鲍曼不动杆菌DP-2降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究.pdf
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1、第38 卷第3期2023年7 月文章编号:2 0 9 6-47 49(2 0 2 3)0 3-0 30 0-11引文格式:李成,刘春敬,柳月,李博文,谢建治.鲍曼不动杆菌DP-2降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究J.林业与生态科学,2 0 2 3,38(3):30 0-310.LI Cheng,LIU Chunjing,LIU Yue,LI Bowen,XIE Jianzhi.Primary research of broad-spectrum and biodegradationpathways of phthalic acid esters by Acinetobacter ba
2、umannii DP-2J.Forestry and Ecological Sciences,2023,38(3):300-310.鲍曼不动杆菌 DP-2 降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究林业与生态科学FORESTRY AND ECOLOGICAL SCIENCESDOI:10.13320/ki.hjfor.2023.0038Vol.38 No.3Jul.2 0 2 3李成1,刘春敬1,柳月1,李博文1,谢建治1(1河北农业大学资源与环境科学学院,河北省农田生态环境重点实验室,河北保定0 7 10 0 1;2省部共建华北作物改良与调控国家重点实验室,河北保定0 7 10 0 1)摘
3、要:微生物降解是修复邻苯二甲酸酯(PAEs)污染土壤的有效途径,本研究以15种邻苯二甲酸酯(PAEs)为目标污染物,研究鲍曼不动杆菌DP-2对直链、侧链及环状取代PAEs的生物降解特性和降解途径。研究结果表明,直链取代PAEs中,随着烷基碳原子数增加,DP-2对PAEs的降解率逐渐升高,其对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)降解率最高,为9 4.52%;对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)的降解率最低,为42.30%;侧链取代PAEs中,DP-2对邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丙烯酯(DAP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)的降解率分别为9
4、 2.33%、52.2 2%、7 7.31%和2 7.7 5%;环状取代PAEs中,DP-2对邻苯二甲酸丁酯(BBP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPHP)、邻苯二甲酸二环已酯(DCHP)的降解率分别为8 9.8 7%、8 0.56%和6 2.9 1%。在此基础上,以DBP为代表性PAEs,采用GC-MS对DP-2的主要降解产物进行了鉴定,主要由DMP、M BP、PA 和苯甲酸衍生物组成,DBP主要通过转酯化和水解2 个途径转化为DMP和MBP,进一步转化为PA,继续被降解为BA。通过对不同取代PAEs降解途径分析,进一步证实了菌株DP-2对PAEs的降解途径。本研究结果表明DP-2降解PAEs具有较
5、好的广谱性,在土壤PAEs污染修复领域具有较好的应用前景。关键词:邻苯二甲酸酯;生物降解;广谱性;降解途径中图分类号:X592Primary research of broad-spectrum and biodegradation pathways ofphthalic acid esters by Acinetobacter baumannii DP-2文献标志码:ALI Cheng 2,LIU Chunjing,LIU Yue,LI Bowen,XIE Jianzhil(1 College of Resources and Environmental Science,Hebei Agri
6、cultural University,KeyLaboratory for Farmland Eco-Environment of Hebei Province,Baoding 0710ol,China;2 State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation,Baoding 071ool,China)Abstract:Microbial degradation was an effective way to repair soil contaminated withphthalate esters(PAEs).
7、In this study,a total of fifteen phthalic acid esters(PAEs)were收稿日期:2 0 2 3-0 1-18基金项目:国家自然科学基金项目(519 0 8 18 9);河北省自然科学基金(2 0 2 2 2 0 40 2 9)。第一作者:李成(19 8 2-),男,河北保定人,硕士研究生,助理研究员,研究方向为土壤环境质量评价与监控。通信作者:谢建治(19 6 9-),男,安徽安庆人,博士,教授,研究方向为农业环境保护。第3期李成,等.鲍曼不动杆菌DP2 降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究selected as target p
8、ollutants to investigate the biodegradation characteristics and degradationpathways of different straight-chain,side-chain and cyclic-chain PAEs by strain Acinetobact-er baumannii DP-2.The results indicated that the degradation rate of PAEs by DP-2 in-creased gradually with the increasing of alkyl c
9、arbon atom number in straight-chain PAEs.The highest degradation rate appeared in the dibutyl phthalate(DBP)treatment with thevalue of 94.52%while the lowest value appeared in the dimethyl phthalate(DMP)treatmentwhich was 42.30%.For the studied side-chain PAEs,the degradation rates of disobutylphtha
10、late(DIBP),di-(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP),diallyl phthalate(DAP)and di-methoxyethyl phthalate(DMEP)of DP-2 were 92.33%,52.22%,77.31%and 27.75%,respectively.For the studied cyclic-chain PAEs,the degradation rates of butyl benzylphthalate(BBP),diphenyl phthalate(DPHP)and dicyclohexyl phthalate(DCHP)
11、of DP-2were 89.87%,80.56%and 62.91%,respectively.Taking DBP as the representative PAEs,the intermediate metabolites of DP-2 were identified by GC-MS,which were mainly com-posed of DMP,MBP,PA and benzoic acid derivatives.DBP was firstly degraded into DMPand MBP via transesterifification and hydrolysi
12、s,further converted into PA,continued to bedegraded into BA.The degradation process of PAEs by DP-2 was further confirmed by ana-lyzing the degradation pathway of different substituted PAEs.The above results proved DP-2 had quite broad spectrum and had good application potential for soil PAEs remedi
13、ation.Keywords:phthalic acid esters;biodegradation;broad-spectrum;degradation pathway邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PA Es)是一类由邻苯二甲酸与不同碳链结构的醇形成的酯,主要包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸-2-乙基已基酯(DEHP)等。该类物质能够增强塑料产品的弹性和柔韧性,通常作为增塑剂被广泛用于农用塑料薄膜、食品包装袋,也可作为添加剂用于建筑材料、玩具、化妆品、农药等2 。其中,DMP、DnBP和DEHP这3种
14、PAEs由于具有典型的内分泌干扰性和潜在的“三致”效应,被美国环保署和中国国家环境监测中心列人“优先控制污染物 3。由于PAEs在农业、工业和生活领域的广泛使用,导致其在土壤、水、空气、污泥等环境介质和生物体内残留严重,已经成为环境中最普遍存在的有机污染物之一,对生态系统和人体健康构成严重威胁-6 。土壤是PAEs重要的储藏库和中转站,科学修复土壤中PAEs污染对于降低生态环境风险和维系土壤健康具有重要意义7。微生物修复由于成本低廉、环境友好被认为是最有前景的PAEs修复技术之一8 。目前,国内外有关PAEs微生物降解的研究很多,研究者陆续从土壤、污泥、河道底泥等不同环境介质中分离筛选出DBP
15、高效降解菌株Pseudomonas sp.YJB6和No-vosphingobium sp.DNB-S3L0-10,DEHP高效降解菌株Acinetobacter sp.SN13和Pseudomonas sp.301XB,上述研究主要侧重于单一短链二烷基类或长链二烷基类邻苯二甲酸酯的微生物降解效果和机理9-12 。此外,一些学者也针对同一降解菌株开展了多种PAEs污染物的降解研究,Chen等从沉积物中筛选分离一株能够以DBP和DEHP作为唯一碳源的降解菌 Cupriavidus oalaticus E313;Zhang等从土壤中筛选分离1株BacillusmojavensisB1811,可以对
16、7 种PAEs进行生物降解14;梁浩花等从设施菜地土壤中筛选分离1株MicrobacteriumSp.MB1,其能够对DMP、D BP和DEHP生物降解15。在土壤中往往是各种PAEs共存,DMP、DEP、D BP、D EH P、BBP等污染物在土壤中的浓度和检出频率均较高,因此,针对同一降解菌株,开展多种PAEs污染降解研究尤为重要。课题组前期从张家口某污水处理厂活性污泥中筛选出1株DBP高效降解菌鲍曼不动杆菌DP-2(以下简称:DP-2)。本研究以DP-2为供试菌株,采用批式培养试验,比较分析该菌株对不同结构类型(直链、侧链和环状)PAEs的降解效果,并以DBP为代表性降解底物,解析该菌株
17、的降解途径,研究结果可为PAEs污染土壤的生物修复提供理论支持。1材料与方法1.1材料供试菌株为课题组前期从污水处理厂活性污泥302中分离筛选的高效DBP降解菌:鲍曼不动杆菌DP-2(保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号No.22236)。1.2仪器、药品和培养基气相色谱一质谱联用仪(GCM S,7 8 9 0 B7000C,美国Agilent公司);紫外分光光度计(UV-5100B,上海元析仪器有限公司);超声清洗器(K Q 52 0 0 D B,昆山超声仪器有限公司);高压灭菌器(G R8 5D A,厦门致微仪器有限公司);大容量全温振荡器(DHZ-DA,太仓实验设备厂)。15种P
18、AEs标准品邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPRP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二王酯(DINP)、邻苯二甲酸二癸酯(DIDP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸双(2 一乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丙烯酯(DAP)、邻苯二甲酸二(2 一甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPHP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二环已酯(DCHP)(分析纯标准品GC99%,上海源叶生物科技有限公司)(见附表)。试验中其他化学试剂均为分析纯,所有溶剂均为色谱纯
19、。牛肉膏蛋白培养基(LB):牛肉膏5g/L,蛋白陈10g/L,NaCl 5 g/L,pH 值为 7.2 7.4。无机盐培养基(MSM):K,H PO 45.1g/L,KHzPO4 2.5 g/L,(NH 4)2 SO 4 2.0 g/L,M g C l20.16g/L,微量元素溶液1.0 mL。微量元素溶液:CaCl20mg/L,Na 2 M o O 42H2O 2.4 mg/L,FeSO4:7H2O 1.8 mg/L,MnCl2:4 H,0 1.5 mg/L。1.3菌悬液的配制将菌株DP-2(甘油保存)接入已灭菌的LB液体培养基中,放人摇床进行富集,培养2 4h,然后,将富集培养好的菌液离心
20、15min,转速为50 0 0rpm,离心后收集离心管底部菌体,将菌体用灭菌的磷酸缓冲液反复冲洗2 3次,再次离心收集菌体,最后,用磷酸缓冲液将菌体重悬,将菌悬液密度调至OD600=1.0(平板计数菌密度约为3.0 10 个/mL),待用。1.4菌株DP-2对不同结构PAEs降解试验1.4.1菌株DP-2对不同直链PAEs降解试验试验选取的直链PAEs主要包括DMP、D EP、DPRP、D BP、D NO P、D O P、D I NP 和 DIDP,将上述各PAEs分别配制成浓度为1g/L的正已烷母液,待用。向盛有50 mL无机盐培养基的锥形瓶中加林业与生态科学人0.5mL配制好的1g/L的正
21、已烷母液,使PAEs的最终浓度为10 mg/L,再按10%的接菌量将菌株DP-2加入上述无机盐培养基中,每个处理3次重复,此外,每组试验设置不接菌的无机盐培养基溶液作为对照(CK),30、150 r p m 下,封口膜密封培养6d,每隔2 4h取样,紫外分光光度计测定菌株DP-2的OD60o值,GC-MS测定锥形瓶溶液中的PAEs浓度,计算 DP-2对 PAEs的降解效率16 1.4.2菌株DP-2对不同侧链PAEs降解试验试验选取的侧链PAEs主要包括DIBP、D EH P、DAP和DMEP,将上述PAEs分别配制成1g/L的正已烷母液,待用。试验过程同1.4.1。1.4.3菌株DP-2对不
22、同环状PAEs降解试验试验选取的环状PAEs主要包括DPHP、BBP和DCHP,将上述PAEs分别配制成1g/L的正已烷母液,待用。试验过程同1.4.1。1.5样品的提取待降解完成后,将50 mL正已烷加入锥形瓶中,超声萃取30 min,对溶液进行分液并收集有机相,通过加入4g无水硫酸钠对有机相进行干燥,浓缩至0.5mL,最后用正已烷对干燥过的有机相进行定容至1mL,放2 mL样品瓶中,用于GC-MS分析16 。1.6降解产物的提取选取降解反应时间在48、7 2 h,分别提取DP-2的降解中间产物(方法同1.5),通过GC一MS检测,将结果比对NIST14数据库进行定性分析。1.7仪器工作条件
23、气相色谱条件:Agilent HP5M SU I 色谱柱(30m0.25mmX0.25m);进样口温度为2 8 0;程序升温:初始柱温8 0,保持1min,以2 0/m i n 上升至2 8 0,保持4min;载气:氮气,流速1mL/min;进样方式:不分流进样;进样量:1uL。质谱条件:电子轰击离子源模式(EI),离子源温度30 0,四极杆温度150,MSD传输线温度30 0,电子能量7 0 eV;扫描范围50 550 m/z16。1.8数据分析采用Oringin9.0和SPSS28.0软件对试验数据进行统计分析。2统结果与分析2.1菌株DP-2对不同直链取代PAEs的降解特征分析2.1.1
24、菌菌株DP-2菌体细胞浓度的动态变化菌株DP-2降解不同直链PAEs过程OD600的变化规律见图1。第38 卷第3期李成,等.鲍曼不动杆菌DP-2降解邻苯二甲酸酯的广谱性及降解途径的初步研究1.21.00.80.60.40.20.050图1DP-2降解不同直链PAEs过程ODoo的变化规律Figure 1Variation law of ODoo during the cultivation ofDP-2 degrading different straight-chain PAEs本试验选用8 种不同的直链取代PAEs作为降解底物,比较分析了菌株DP2 在培养过程的菌体细胞浓度(OD600)
25、动态变化。由图1可见,菌株DP-2能够以试验选取的8 种PAEs为底物进行生长。从总体趋势来看,菌株DP2 在培养的第1天即进人对数增长期;到第2 天后,各处理的OD600达到最大值,为0.8 30.9 6;培养3d后进入衰亡期,各处理的OD60o开始下降;到第6 天培养结束时,各处理的OD60维持在0.410.50 左右。各处理的OD600在对数增长期无显著性差异(P0.05),进入衰亡期后有些不同,具体表现在以DNOP和DINP为底物的处理具有较高的OD600。例如,在第4天时,DNOP处理的OD600为0.6 9,显著高于其他试验处理(P0.05)。2.1.2菌株DP-2对直链取代PAE
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