有氧运动对APP_PS1小...超微结构和功能的可塑性作用_於来康.pdf
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1、有氧运动对APP/PS1小鼠海马突触超微结构和功能的可塑性作用Impact of Aerobic Exercise on the Synaptic Ultrastructure and Function in Hippocampus from APP/PS1 Mice於来康,吕媛媛,顾博雅,赵丽*YU Laikang,LYU Yuanyuan,GU Boya,ZHAO Li*摘要:目的:通过对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型进行8周有氧运动,探讨有氧运动对AD小鼠早期海马突触超微结构及功能的可塑性影响。方法:24只健康雄性、清洁级4月龄APP/PS1小鼠,随机分为8
2、周有氧运动组(AE)和安静组(AS),每组12只。24只健康雄性、清洁级4月龄C57BL/6J小鼠作为对照组,随机分为8周有氧运动组(CE)和安静组(CS),每组12只。AE组和CE组小鼠进行8周跑台运动。跳台回避实验检测各组小鼠行为学变化;脑片膜片钳技术检测各组小鼠海马LTP的变化;透射电镜观察各组小鼠海马突触数目和超微结构的变化。结果:与正常对照组小鼠相比,6月龄APP/PS1小鼠在跳台回避实验中的错误次数显著增加(P0.01),潜伏期显著减少(P0.01),达标率显著降低(P0.05);海马LTP的斜率显著降低(P0.01);CA1区突触数目显著减少(P0.05),CA1区和CA3区突触
3、界面曲率显著减小(CA1区P0.01;CA3区P0.05),突触活性区长度显著缩短(CA1区P0.01;CA3区P0.05),PSD厚度显著减小(CA1区P0.05;CA3区P0.01),突触间隙宽度显著增大(P0.01)。8周有氧运动可显著降低APP/PS1小鼠在跳台回避实验中的错误次数(P0.01),增加潜伏期(P0.01)和达标率;增强海马LTP(P0.01);增加海马CA1区和CA3区突触的数目(CA1区P0.01;CA3区P0.05)、突触界面曲率(P0.05)、突触活性区长度(CA1区P0.01;CA3区P0.05)、PSD厚度(CA1区P0.05;CA3区P0.01),减小海马突
4、触间隙宽度(P0.01)。结论:规律有氧运动通过改善6月龄APP/PS1小鼠海马突触超微结构损伤,增加海马突触形态可塑性,增强海马LTP,是运动改善其行为学能力的突触机制之一。关键词:有氧运动;突触可塑性;超微结构;长时程增强;APP/PS1小鼠Abstract:Objective:To explore the effects of aerobic exercise on the synaptic ultrastructure and function in hippocampus,eight weeks of aerobic exercise was carried out in APP/P
5、S1 mice.Methods:Twenty-four healthy male,clean-grade 4-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into 8-week aerobic exercise group(AE)and sedentary group(AS),with 12 mice in each group.Twenty-four healthy male,clean-grade 4-month-old C57BL/6J mice were used as the control group and we
6、re randomly divided into 8-week aerobic exercise group(CE)and sedentary group(CS),with 12 mice in each group.Mice in the AE group and CE group were subjected to a treadmill exercise protocol for 8 weeks.Step-down fear conditioning was conducted to measure behavioral changes,patch-clamp was used to d
7、etect LTP in hippocampus,and synaptic number and ultrastructure were assessed using transmission electron microscopy.Results:Compared with the control group,the error frequency(P0.01)and the width of synaptic cleft(P0.01)in the hippocampus of 6-month-old APP/PS1 mice were significantly increased,the
8、 latency(P0.01),the standard rate(P0.05),the slope of LTP(P0.01),the number of synapses in hippocampal CA1(P0.05),the synaptic interface curvature in hippocampal CA1(P0.01)and CA3(P0.05),the length of active zone in hippocampal CA1(P0.01)and CA3(P0.05)and the thickness of PSD in hippocampal CA1(P0.0
9、5)and CA3 中国体育科技2023 年(第59卷)第2期CHINA SPORT SCIENCE AND TECHNOLOGYVol.59,No.2,18-24,2023文章编号:1002-9826(2023)02-0018-07DOI:10.16470/j.csst.2021109基金项目:国家自然科学基金项目(31571229);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2021QN001)第一作者简介:於来康(1991-),男,讲师,博士,硕士研究生导师,主要研究方向为体能训练与神经可塑性、运动与健康促进,E-mail:。通信作者简介:赵丽(1970-),女,教授,博士,博士研究生导师
10、,主要研究方向为运动与神经可塑性,E-mail:。作者单位:北京体育大学,北京 100084Beijing Sport University,Beijing 100084,China.18於来康,等:有氧运动对APP/PS1小鼠海马突触超微结构和功能的可塑性作用(P0.01)were significantly reduced.Eight weeks of aerobic exercise could significantly reduce the error frequency(P0.01)and the width of synaptic cleft(P0.01)in the hippo
11、campus,and increase the latency(P0.01),the standard rate,the slope of LTP(P0.01),the number of synapses in hippocampal CA1(P0.01)and CA3(P0.05),the synaptic interface curvature in hippocampus(P0.05),the length of active zone in hippocampal CA1(P0.01)and CA3(P0.05)and the thickness of PSD in hippocam
12、pal CA1(P0.05)and CA3(P0.01)of APP/PS1 mice and it can also decrease the width of hippocampal synaptic space.Conclusions:Regular aerobic exercise can alleviate damage of hippocampal synaptic ultrastructure of 6-month-old APP/PS1 mice,increase hippocampal synaptic plasticity,and enhance hippocampal L
13、TP.This might be one of the synaptic mechanisms of exercise to improve the behavior ability.Keywords:aerobic exercise;synaptic plasticity;ultrastructure;LTP;APP/PS1 mice中图分类号中图分类号:G804.2 文献标识码文献标识码:A阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,主要临床表现为记忆丧失和认知功能障碍(Kim et al.,2020)。有研究证实,在AD患者或AD动物模型早期就出现
14、与学习记忆能力下降密切相关的突触功能紊乱和突触丢失,并存在于 AD 疾病的整个发生、发展过程中(杜果 等,2017;於来康,2016)。突触作为神经元间信息传递和加工的枢纽,在神经递质的储存、释放和再摄取的过程中具有关键作用,是中枢神经系统可塑性变化最敏感的部位。突触可塑性包括突触传递可塑性、突触发育可塑性和突触形态可塑性,其中突触结构的改变可引起突触传递效能的变化。研究显示,突触形态可塑性与长时程增强(long-term potentiation,LTP)的诱导直接相关,在学习记忆中具有重要作用(Kulik et al.,2019)。突触的数目、突触界面曲率、突触活性区长度、突触后致密物(p
15、ostsynaptic density,PSD)厚度和突触间隙宽度等突触超微结构的改变都会导致突触功能的改变,被认为是突触功能可塑性的结构基础之一(Xiao et al.,2014)。目前有流行病学资料证实运动对防止脑老化、脑功能的维持具有促进作用(Engeroff et al.,2018;Tyndall et al.,2018)。2015 年阿尔茨海默病协会国际会议中明确指出,体育锻炼对AD和其他痴呆症具有缓解发病进展,在有可能的情况下预防或延缓疾病的发生。APP/PS1 小鼠作为 AD 的经典动物模型之一,通常在 6 月龄出现 A 沉积和记忆保持能力受损,9月龄出现明显学习记忆等行为学障碍
16、(Hu et al.,2013)。前期研究表明,8周有氧运动可以诱导成年大鼠海马突触密度增加(李岩 等,2013);改善4月龄APP小鼠空间记忆能力(吕媛媛,2011);增加 4 月龄 APP/PS1 小鼠突触后致密物的含量(顾博雅 等,2014);增加 8 月龄 APP/PS1小鼠海马Ras、Drebrin含量,缓解AD时树突棘的丢失,增加树突棘可塑性(顾博雅 等,2020);增加 8 月龄 APP/PS1小鼠海马 CaMK 含量,上调 AMPA 受体 GluA1 亚基活性,增加突触可塑性(於来康 等,2017)。本研究在前期研究基础上,探讨有氧运动对6月龄APP/PS1小鼠行为认知能力、海
17、马 LTP 以及海马 CA1 区和 CA3 区突触数目及超微结构的影响。1 材料与方法1.1实验动物与训练方案24 只健康雄性、清洁级 4 月龄 APP/PS1 小鼠,随机分为8周有氧运动组(AE)和安静组(AS),每组12只。24只健康雄性、清洁级4月龄C57BL/6J小鼠作为对照组,随机分为8周有氧运动组(CE)和安静组(CS),每组12只。实验动物由北京华阜康生物科技有限公司提供 动物许可证号:SCXK(京)2009-0007。小鼠饲养于北京体育大学动物实验室,国家标准啮齿类动物分笼饲养,自由饮食饮水,室温(222),湿度45%55%。动物实验的处理符合北京体育大学运动科学实验伦理委员会
18、的相关规定。AS 组和 CS 组小鼠每天自由饮食,不做运动干预。AE组和CE组小鼠适应性饲养1周后,进行3天适应性跑台训练,每天60 min,运动负荷10 m/min,坡度为0。适应性训练结束后开始8周的有氧运动训练,每周5次,周六、日停训。运动时间和负荷:运动组先以 12 m/min 的速度运动 10 min,然后再以 15 m/min 的速度运动 50 min,跑台坡度为0。1.2行为学检测选用8通道小鼠跳台实验系统(SDT-8,四川成都泰盟软件有限公司)检测各组小鼠的行为学变化。实验包括2次相隔至少1 h的电击训练和1次24 h后的记忆保持测试。1)第一次电击训练:实验第一天需要进行2次
19、电击训练,2 次电击训练的时间间隔为 60 min。具体方法:将小鼠放置于圆柱形的跳台之上,当它离开跳台跳至刺激栅极时,给予小鼠四肢 28 V 的电击,根据仪器设定,该电压为能够引起小鼠发声和退缩的最小电压。训练结束后,将小鼠放回笼内,用 75%酒精清洁跳台和箱体,并擦干,待酒精完全挥发后进行下一只小鼠的训练。该跳台实验系统共配备8个实验通道,理论上一次可以同时对8只小鼠进行训练,由于频繁开关箱门产生的声音和振动会对其他通道小鼠产生影响,因此,为了保证训练的效果,本研究的实验过程中每次训练 1 只小鼠。2)第二次电击训19中国体育科技2023年(第59卷)第2期练:第一次电击训练结束 1 h
20、后重复上述操作,并记录小鼠的跳台潜伏期。如果小鼠在跳台上滞留的时间超过60 s(潜伏期超过 60 s,该潜伏期记为潜伏期 1),即可认为小鼠已经记住先前的刺激,此时不给与电击刺激,将小鼠放回笼内,清洁跳台和箱体,进行下一只小鼠的训练;如果小鼠在跳台上滞留的时间小于 60 s,第二次电击训练 1 h后再次重复训练1次。如仍未达标,则予以淘汰。3)记忆保持实验:在第一次电击训练结束 24 h 之后进行。具体操作方法与电击训练相同,但是不给与电击刺激。记录小鼠从跳台上跳到刺激栅极的错误次数:若小鼠从跳台上跳下来,错误次数记为 1,并记录小鼠在跳台上滞留的时间(该时间记为潜伏期2);将小鼠放回跳台后若
21、再次跳下,错误次数记为 2,以此类推,共进行 300 s 的测试。如果小鼠在跳台上滞留的时间超过 300 s 仍未从跳台上跳下,则终止实验。实验过程中除记录小鼠的潜伏期和错误次数外,还需计算达到回避标准的小鼠数量。达标标准:记忆保持实验测得的潜伏期(潜伏期2)大于第二次电击训练所测得潜伏期(潜伏期1)的3倍且超过60 s。通常以潜伏期和错误次数作为判断小鼠记忆力的定性指标,达标率作为判断小鼠记忆力的定量指标。1.3海马LTP记录小鼠异氟烷吸入麻醉后,断头,取脑,分离出左右两侧海马组织置于95%O2和5%CO2混合气饱和的蔗糖切片液中。切片液的成分及浓度:蔗糖68.00 mmol/L,KCl 2
22、.50 mmol/L,NaH2PO4 1.25 mmol/L,MgSO4 5.00 mmol/L,NaHCO3 26.00 mmol/L,葡萄糖 25.00 mmol/L,pH 7.37.4(Schurman et al.,2019)。刀片修块后,4%低熔点琼脂包埋,待琼脂凝固后,取出琼脂包裹的脑组织块,再次修块并固定在VT1200 S振动切片机(Leica,德国)上,经混合气体饱和的 4 切片液中以 350 m 的厚度切片,海马脑片在切片液中孵育 5 min 后,移至 95%O2和 5%CO2混合气饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)中常
23、温孵育1 h以上。aCSF的成分及浓度:NaCl 119.00 mmol/L,KCl 3.00 mmol/L,CaCl2 2.00 mmol/L,MgCl2 1.00 mmol/L,NaH2PO4 1.25 mmol/L,NaHCO3 25.00 mmol/L,葡萄糖 10.00 mmol/L,pH 7.37.4。打开蠕动泵,建立aCSF循环,并持续通95%O2和5%CO2的混合气。调节记录槽液面,使其高度适中,通过蠕动泵维持 aCSF 流速为 24 ml/min。将脑片从孵育槽转移至记录槽,盖网固定。采用电流钳模式,epsodic stimulation模式下记录。光学显微镜下定位海马CA1
24、区后,将装有1 mmol/L NaCl的玻璃微电极(电极电阻为12 m)置于海马CA1辐射层,将刺激电极置于海马schaffer侧支纤维处,两者间距约 300 m。按一定间隔递增调节刺激强度,记录不同刺激强度下所诱发的场电位幅度变化,得到最大场电位幅度。调节刺激强度,使诱发的场电位幅值约为最大场电位幅度 40%,刺激个数为 1,刺激持续时间为 500 s,每个 sweep 间隔 1 min,稳定记录 20 min 作为baseline。通过刺激电极给予15串TBS刺激,每串间隔时间为20 s。每一串TBS由10组4个100 Hz的单刺激组成,组间间隔200 ms(Schurman et al.
25、,2019)。刺激强度同baseline,刺激持续时间为500 s,每个sweep间隔1 min,记录1 h。1.4突触数目和突触超微结构检测采用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观测各组小鼠海马CA1区和CA3区突触数目的变化。小鼠异氟烷吸入麻醉,无呼吸、无痛觉后固定于鼠板上,打开胸腔充分暴露心脏,灌注 50 ml 生理盐水,随后缓缓注入4%多聚甲醛-磷酸缓冲液(pH 7.4),待小鼠的舌、腹腔脏器、四肢完全僵硬时,停止灌注,拔掉输液管。断头取出脑组织。将整个脑组织置于 2.5%的戊二醛固定液中,4 下固定 20 min,然后在冰盘上将脑组织
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