原生质体融合结合基因编辑技...提高酿酒酵母2-苯乙醇产量_林路成.pdf
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1、食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES182023 Vol.49 No.5(Total 473)DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 031898引用格式:林路成,徐志伟,张建泽,等 原生质体融合结合基因编辑技术显著提高酿酒酵母 2-苯乙醇产量 J 食品与发酵工业,2023,49(5):18 24 LIN Lucheng,XU Zhiwei,ZHANG Jianze,et al Protoplast fusion combined with gene editing technolo-gy significantly improves
2、 the ability of Saccharomyces cerevisiae to produce 2-phenylethanol J Food and Fermentation Indus-tries,2023,49(5):18 24原生质体融合结合基因编辑技术显著提高酿酒酵母 2-苯乙醇产量林路成1,徐志伟1,张建泽1,单玉栋1,肖峰1,徐浩1,李芩萍1,易蒲红1,汪琨1*,朱廷恒1,2*1(浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州,310014)2(中国农业大学 有机循环研究院(苏州),江苏 苏州,215000)摘要酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已用于生产
3、天然2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE),但其产量低,耐受性差。该研究筛选出 3 株具有不同优良性状的酿酒酵母菌株,其中菌株 LSC-1 的 2-PE 产量为 3 41 g/L,菌株NGE 对 2-PE 的耐受性达 3 60 g/L,菌株 S C-1 耐热性好并能在 41 下生长。以这 3 株菌为亲本,通过 2 轮原生质体融合获得融合子菌株 H2-16,对 2-PE 的耐受性提高了 20%。以 L-苯丙氨酸为底物,发酵转化 36 h,2-PE产量达到 4 31 g/L,与亲本菌株 LSC-1 和 2-PE 工业生产菌株 CWY132 相比,分别提高 26 4%和 38 1%。
4、利用CISP/Cas9 系统,在 H2-16 中构建了含突变的 as 特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子 CDC25(W1416C)菌株,2-PE 的产量提高了 8%。在 H2-16 中过表达艾氏途径合成 2-PE 关键基因 AO8,AO10 和 ADH2 未能提高2-PE 产量。研究为筛选合成 2-PE 等天然产物的新型酿酒酵母菌株及其育种提供了一种有效策略。关键词酿酒酵母;2-苯乙醇;耐受性;原生质体融合;CISP/Cas9第一作者:硕士研究生(朱廷恒副教授和汪琨副教授为共同通信作者,E-mail:thzhu zjut edu cn;jekiwk zjut edu cn)基金项目:青海省重点研发与
5、转化计划项目(2022-SF-147);浙江诺睿特生物科技有限公司项目(KYY-HX-20180368)收稿日期:2022-04-15,改回日期:2022-05-232-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE)是一种芳香族化合物,广泛用于食品和化妆品行业。2-PE 主要通过化学合成生产,但此法会产生有毒副产物。利用微生物转化进行天然 2-PE 的生产受到了广泛关注1。其中,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最主要的生产菌株。酿酒酵母通过莽草酸途径(从头合成)和艾氏途径合成 2-PE2。最近研究表明通过强化酿酒酵母莽草酸途径构建的工程菌株 JM26 产 2-
6、PE 达643 mg/L3。然而,从头途径合成2-PE 产量低,要实现工业化生产,仍然面临着代谢工程方面的巨大挑战4。当 L-苯丙氨酸(L-Phe)是培养基中唯一的氮源时,2-PE 主要通过艾氏途径合成。L-Phe 由芳香族氨基酸氨基转移酶 Aro9 催化生成苯丙酮酸,然后通过苯丙酮酸脱羧酶 Aro10 脱羧为苯乙醛,再由醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)还原为 2-PE5,2-PE的工业生产主要依赖于该途径。为了提高酿酒酵母的 2-PE 产量,可用诱变育种、基因组改组、基因工程和基因编辑等方法2,6。这些方法在菌株改良的初始阶段有一定效果,尤其是在产量较低的菌株中
7、。酿酒酵母 S288C 中过量表达转氨酶AO8 和苯丙酮酸脱羧酶 AO10 后,2-PE 产量达到2.61 g/L 7。多个相关基因组装构建的酿酒酵母菌株YS58 在5 L 发酵罐中的 2-PE 产量达到 6 3 g/L 8。我们前期对酿酒酵母 CWY132 菌株进行了研究,通过优化培养条件,2-PE 产量达到 3 52 g/L9,发酵罐小试其产量达 4 1 g/L10。以糖蜜为碳源,进一步利用液-液两相的分批补料发酵及工艺进行转化,2-PE产量最高达到 9 03 g/L11。当产量达到一定水平时,2-PE 对酵母细胞的毒性便成了限制产量的瓶颈。此外,酿酒酵母在转化2-PE 的过程中会产生较多
8、的副产物乙醇,从而与 2-PE 产生协同抑制效应12。通过原位产物回收技术,2-PE 的产量从 2 28 g/L 增加到 5 14 g/L13。然而,去除回收残留有机溶剂存在困难,限制了其应用2。因此,提高菌株对 2-PE 的耐受性是进一步提高产量的潜在途径。酿酒酵母菌株的耐受性是由多基因控制的复杂综合性状,通过随机诱变或基因工程提高菌株耐受性的策略相对来说效率较低。因此,有必要将传统方法和基因工程方法相结合来改良菌株。我国酿酒业高度发达,酵母菌株的多样性非常丰富,是重要的资源宝库。例如,在制备茅台酒时,酿酒酵母在高温、高酸和高乙醇浓度等多种应激因素的环境中生长。在制曲过程中,温度达 60,p
9、H 值在 2.0左右,乙醇体积分数达82%以上 14。生长在这种特殊研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)19环境中的微生物区系具有独特的物理和化学特征,可以从中筛选出耐受性更好的菌株。例如,筛选出的耐热胁迫酿酒酵母菌株可耐受25 g/L 的2-PE,显著高于不耐热菌株(1 g/L),相应地,2-PE 产量达45 g/L 15。在获得具有不同优良性状的多个酵母菌株后,有必要将这些性状聚合到一个酵母菌株中。原生质体融合显示出高效的潜力,可以在不需要了解具体机制的情况下实现。该方法已用于改善酿酒酵母的乙醇生产性能,融合菌株同时获得双亲的发酵性能和乙醇耐受性16。酿酒酵母和巴斯德酵
10、母菌的融合菌株SP2 18 的乙醇产量为 74 65 g/L,而亲本的乙醇产量分别为 33 12 和 65 44 g/L17。酿酒酵母和乙醇假丝酵母的融合菌株 6 在生产高品质低醇苹果酒方面具有巨大潜力18。这些研究表明,原生质体融合是酿酒酵母菌株改良的有效策略。CISP/Cas9 技术已成功应用于酿酒酵母的基因操作,DI-CISP(Delta 整合的 CISP)可以实现外源基因的高拷贝整合19。研究表明酿酒酵母cdc25(as 家族鸟嘌呤核苷酸交换因子)的点突变菌株(W1416C)可以在 39 高温下有效地进行乙醇发酵,产量为6 g/L20。但是 cdc25 突变对2-PE 产量是否有促进作
11、用尚不明确。在本研究中,我们筛选出 3株耐受性好、2-PE 产量高的酿酒酵母菌株,经原生质体融合后,进一步利用 DI-CISP 对融合菌株进行研究,探索 cdc25 及艾氏途径关键酶基因对 2-PE 产量的影响。构建策略见电子增强出版附件 1(ht-tps:/doi org/10 13995/j cnki 11-1802/ts 031898)。1材料与方法1 1菌株、培养基和试剂1 1 1菌株酿酒酵母 CWY132、酿酒酵母 NGE,诺睿特生物公司;LSC-1(CICC 33068)、LSC-2(CICC 1005)和LSC-3(CICC 32304),中国工业微生物保藏中心;S C-1 分离
12、于浙江绍兴黄酒酿造样品。其他各菌株及来源见电子增强出版附件 2(https:/doi org/1013995/j cnki 11 1802/ts 031898)。1 1 2试剂及其配制方法NaH2PO4 2H2O、山梨醇、-巯基乙醇、EDTA-2Na、酵母基因组 DNA 提取试剂盒、蜗牛酶,上海生工生物工程有限公司;崩溃酶,美国 Sigma-Aldrich 公司;cDNA 转录试剂盒、Power SYBgreen PC Mas-ter Mix 试剂,美国 Thermo Fisher Scientific 公司。0 2 mol/L PB 溶 液:87 7 mL 0 2 mol/LNaH2PO4
13、2H2O 和 12 3 mL 0 2 mol/L Na2HPO42H2O,pH 6 0。PBS 溶液:50 mL 0 2 mol/L PB 溶液和 450 mL1 mol/L 山梨醇溶液,pH 6 0。细胞壁裂解预处理液:取 0 2 mL-巯基乙醇和2 233 g EDTA-2Na,溶解于 PBS 中,定容至 100 mL,0.22 m 过滤器过滤。1 1 3培养基YPD 培养基用于菌株活化和分离。YPDS 培养基(原生质体再生培养基):YPD 中添加 182 17 g/L山梨醇。2-PE 发酵培养基(g/L):葡萄糖 30,MgSO40 5,K3PO45,酵母提取物 1 5,L-Phe 5。
14、1 2酵母菌株的分离与鉴定样品进行稀释后涂布在 YPD 平板上于 30 培养 48 h,通过菌落形态和显微观察选择酵母菌,分离纯化后进行分子鉴定。酵母基因组 DNA 用试剂盒提取。ITS(Internal Transcribed Spacer)的全序列用引物对Seq-F(5-CGCCAGGTTTTCACAGAC-3)/Seq-(5-GAGCGATACATTTCACAGC-3)进行 PC 扩增。将 ITS 序列与 GenBank 核酸数据库进行相似性分析,用 MEGA7 0 软件进行系统发育树分析。1 32-PE 生长曲线及耐高温性的测定用光密度法(OD600)测定各菌株的生长曲线。用梯度稀释滴
15、板实验分析 2-PE 的耐受性,将酵母细胞浓度调整为107个细胞/mL,取5 L 稀释液滴在含有2-PE 的 YPD 平板上培养。1 4原生质体制备、融合、再生通过离心收集新鲜培养的酵母细胞,在 PBS 溶液中与 4 mL 酶液混合,酶液由 70 mg/mL 蜗牛酶和2 mg/mL 崩溃酶组成,30、60 r/min 下酶解 2 h。利用双亲灭活的方法进行细胞融合和选择,使灭活效率95%。离心收集原生质体,PBS 洗涤并悬浮,一亲本的悬浮液置于 25 W 紫外线灯下照射,涂布于YPDS 平板,在 30 培养,另一亲本在 60 水浴中处理。处理后的双亲原生质体浓度调整为 107/mL,各取 0
16、5 mL 混合并离心后悬浮在 1 mL 40%(质量分数)聚乙二醇 6000,30 避光培养 25 min。离心收集原生质体,PBS 稀释后涂布于 YPDS 板在 30 培养观察,等待融合子出现。1 5融合子鉴定细胞 DNA 含量按照公式(1)计算18:(DNA)/(gmL1)=OD260/280 Ki E1 000(1)食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES202023 Vol.49 No.5(Total 473)式中:Ki,稀释因子;E,1 个紫外吸收单位代表 DNA质量浓度等于 50 g/mL。1 6使用 DI-CISP 构建艾氏途径和 cdc25 突
17、变体中的基因过度表达融合菌株 H2-16 为宿主,将艾氏途径中关键酶基因 AO8、AO10 和 ADH2 分别由组成性启动子磷酸甘油酸激酶驱动表达,整合在酿酒酵母基因组的delta 位点。将这 3 个基因组合,获得 7 种类型菌株:AO8,AO10,ADH2,AO8+AO10,AO8+ADH2,AO10+ADH2 和AO8+AO10+ADH2(表示超表达)。DI-CISP 基因编辑参考文献 20进行。通过 LiAc 介导的方法转化酵母,利用构建特异性引物(正向引物位于目标基因的开放阅读框内,反向引物位于 delta 位点)对转化子进行了 PC 鉴定。通过 PC 引入 cdc25 基因的点突变,
18、并如上所述构建突变株。引物见电子版增强出版附件 3(https:/doi org/10 13995/j cnki 11-1802/ts 031898)。1 7qT-PC 分析使用 cDNA 转录试剂盒进行转录,以 1 g 总NA 为模板合成 cDNA。以 ACT1 基因作为内参,进行 qT-PC,在 7500 eal-Time PC 系统使用 PowerSYBgreen PC Master Mix 试剂进行扩增。引物见电子版增强出版附件 3(https:/doi org/10 13995/jcnki 11-1802/ts 031898)。1 82-PE 发酵生产及效价测定对数生长期的酵母细胞以
19、 10%(体积分数)的接种量添加到含有 5 g/L L-Phe 的 50 mL 发酵培养基中,30,200 r/min 发酵 36 h。发酵液离心后取上清液用气相色谱测定 2-PE 的浓度。向样品中加入200 L 内标溶液(甲基异丁基甲醇 1 g/L 水溶液),并混合500 L 乙酸乙酯。取上层有机相测量(岛津 GC2014)。独立进行3 次实验,每个处理至少3 个重复。1 9数据处理实验重复 3 次,使用 GraphPad 作图及数据分析。2结果与讨论2 1酵母菌分离鉴定共筛选获得 25 株酵母菌株(电子版增强出版附件 2)。通过菌落形态分析、显微观察和分子鉴定,鉴定出 19 株酿酒酵母、2
20、 株 Wickerhamomyces anomalus、2 株 Pichia pastoris、1 株 Torulaspora delbrueckii 和 1 株Candida anglica。根 据 ITS 序 列 分 析,工 业 菌 株CWY132 与从源于四川的样品中分离的 SC001、SC003 和 SC009 之间相似性高,与 GenBank 中的酿酒酵母 JYC2558 菌株遗传关系接近。来自CICC 的LSC-1和来自甘肃的 SC008 显示出高度同源性,而从浙江衢州分离的 S C-1 与绍兴分离的 S C-2 遗传上并不相近,亲缘关系见系统发育树(电子版增强出版附件 4,htt
21、ps:/doi org/1013995/j cnki11-1802/ts031898)。2 2分离菌株的性状测定以工业菌株 CWY132 为参考,对分离的酵母菌株从 2-PE 产量、2-PE 耐受性及高温耐受性进行评价。结果表明,不同菌株的 2-PE 产量差异显著。酿酒酵母的 2-PE 合成能力高于其他酵母菌。有 6 株酵母的 2-PE 产量在 1 2 g/L,4 株低于 1 g/L。5 株酿酒酵母(LSC-1、SC002、SC003、SC004 和 SC005)的2-PE 产量稳定在 3 4 g/L 以上,高于工业菌株CWY132(电子版增强出版附件 5,https:/doi org/10
22、13995/j cnki 11-1802/ts 031898),表明酿酒酵母在 2-PE 的合成中具有天然优势。上述 5 株 2-PE 产量较高的酿酒酵母生长速率显著高于 CWY132,其中LSC-1 生长速率最高,其 2-PE 产量也高。2-PE 耐受性测定发现在2 80 g/L 时,NGE、S C-1 和 LSC-1 的生长明显优于 CWY132。在360 g/L 时,NGE 生长最好(图 1-a)。高温耐受性测定发现,在 40 时,CWY132 的生长受到显著抑制,而其他 3 株仍能生长。在41 培养48 h 后,只有 S C-1 生长(图 1-b),表明S C-1 能够抵抗高温胁迫。综
23、上,以 LSC-1、NGE 和S C-1 这3 株菌作为原生质体融合的亲本菌株。a 不同浓度 2-PE 胁迫;b 高温胁迫图 1酿酒酵母菌株在 2-PE 和高温胁迫下的耐受性测定Fig 1Tolerance test of S cerevisiae strains understress of 2-PE and high temperature研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)212 3第一轮原生质体融合获得耐受性增强的融合子以 NGE 和 S C-1 为亲本进行第一轮原生质体融合,共获得 20 个融合子,其中 H1-4 与 NGE 生长性能相近,但在 2-PE 质量浓度
24、为 3 60 g/L 时,耐受性提高(图 2-a)。在 40 下生长性能比较发现,H1-4 与 S C-1 耐热性相近,表明其从亲本中同时获得了高温和2-PE 耐受性(图2-b)。H1-4 的2-PE 产量为211 g/L,比亲本分别增加了11%和24%(图2-c)。a 在36 g/L 2-PE 胁迫下生长;b 在40 下生长;c 2-PE 产量图 2第一轮原生质体融合子筛选Fig 2Screening of strains with 2-PE tolerance fromthe first round of protoplast fusants注:*表示差异显著性(P 0 05)(下同)2
25、4第二轮原生质体融合获得 2-PE 高产融合子将 H1-4 和 LSC-1 作为亲本进行第二轮原生质体融合,共获得约 100 个融合菌株,根据高温耐受性分为 A 至 C 级。A:接近 LSC-1 水平;B:LSC-1 和H1-4 之间;C:接近 H1-4 的水平(图 3-a)。C 级融合子中只有几株的2-PE 产量接近 H1-4(2 11 g/L),其余都低于 H1-4,接近第一轮亲本 SC-1 的产量1.67 g/L。B 级融合子的耐受性没有达到 H1-4 的预期水平,但它们的产量相对较高。其中一株融合子H2-16 的 2-PE 为 4 05 g/L,比亲本 LSC-1 增加18.8%。另一
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