一种基于光交联明胶-聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物_安玉川.pdf
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1、第 卷第期 年月太原理工大学学报 引文格式:安玉川,成荣,孙蕾,等一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物太原理工大学学报,():,():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金面上资助项目();国家自然科学基金重点资助项目()第一作者:安玉川(),硕士研究生,()通信作者:桑胜波(),教授,博士生导师,主要从事皮肤组织工程再生方面的研究,()一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物安玉川,成荣,孙蕾,桑胜波(太原理工大学 微纳传感与人工智能感知山西省重点实验室,新型传感器与智能控制教育部重点实验室,太原 ;山西省六维人工智能生物医学研究院,太原 )摘要:从改善神经组织再生材料的理
2、化性能角度出发,选择生物相容好的光交联明胶()和亲水聚合物聚丙烯酰胺()构建复合水凝胶支架,用于支持雪旺细胞生长。以纯 作为对照,分别测试不同浓度的光交联明胶聚丙烯酰胺复合水凝胶()的形貌、理化性能和机械性能;观察雪旺细胞在支架上的生物相容性、增长情况以及分化程度。实验结果表明,可以改善 支架的机械性能,当 与 的质量分数分别为 和 时,该支架具有良好的生物相容性,可促进雪旺神经细胞分化。因此,开发基于 复合水凝胶支架可作为一种理想的神经组织工程构建物。关键词:光交联明胶;聚丙烯酰胺;雪旺细胞;神经组织工程中图分类号:文献标识码:文章编号:(),(.,.,;.,):,()(),;,:;时至今日
3、,神经损伤引发的神经功能障碍仍严重影响人类的健康与生活。在过去的几十年中,许多天然聚合物(如胶原、丝素蛋白)及合成聚合物被开发并成功用于周围神经损伤的修复。但效果仍然不如自体移植物,这是由于未达到周围神经修复的黄金标准。因此,开发用于神经再生的组织工程构建物仍具有很大的研究和临床价值。在 世纪 年代,有研究者将硅胶管成功应用于临床修复,但是它不可降解的特性,降低了神经修复效果,不利于神经组织的生长。因此,人们开始使用可降解的生物材料来制造神经组织工程构建物,如明胶、壳聚糖和海藻酸钠等,这类材料被广泛应用,但是其在机械性能方面仍有缺失。近年来,使用光固化明胶()和甲基丙烯酰胺取代的弹性蛋白原()
4、的合成制备可调节的机械性能神经组织工程构建物,具有良好的实验结果,但该材料制作成本高,机械性能调节范围较小,仍具有一定的局限性。因此,研究可调节机械性能的复合生物材料仍有价值。是一种以明胶为基底,通过接枝反应使得甲基丙烯酸酐基团接入,进而生成可由蓝光引发聚合凝胶的生物合成材料,具有良好的生物相容性和生物降解性,被广泛应用于生物组织再生,包括关节组织、心肌组织 等。但是,这种水凝胶在体内降解速率过快,且机械性能较弱,不利于神经组织细胞长期的黏附。聚丙烯酰胺()是一种亲水性好且柔韧强的生物合成材料,具有良好的机械性能和可控的降解性能,现已广泛应用于生物化学及医药 领域。通过添加催化剂可激发 本身的
5、光固化特性,提高复合水凝胶的可塑性,并且改变 的比例,可实现复合水凝胶的弹性调节 。然而,纯 水凝胶材料生物相容性较差,不适合作为组织工程神经构建物。综上所述,本文根据两种材料的特点,制备了 复合水凝胶作为雪旺细胞的体外三维生长环境,并表征了不同比例 复合水凝胶的形貌、理化性能和机械性能,同时测试了雪旺细胞在复合水凝胶上的体外生长状况,评估了支架对雪旺细胞生长、分化的影响,优化了复合水凝胶的混合比例,制备出机械性能强且生物相容性好的组织工程神经构建物。实验材料制备 制备由文献 可知,明胶与甲基丙烯酸酐()能够发生接枝反应,将甲基丙烯基团引入到明胶上,得到可由紫光引发聚合的 具体操作方法如下:称
6、取明胶加入到 磷酸缓冲盐溶液(溶液)中;将溶液整体移至 水浴锅中使明胶完全溶解,配成 的明胶溶液;将 的以 的速度加入到 的明胶溶液中,并且将上述溶液在 水浴锅中搅拌反应;随后加入 的 溶液(预热至),用于稀释 与明胶的反应溶液;后将反应液装入 的透析袋中;后将反应液离心,取上清液冷冻干燥得到 复合水凝胶制备首先将 蓝光引发剂溶于超纯水中配置成质量浓度为的溶液;加入 配置成 的光交联明胶溶液。然后向溶液加入预定比例的丙烯酰胺()单体,搅拌均匀后,倒入直径为 的圆形模具中,在紫外灯下照射 ,固化聚合成 复合水凝胶支架。混合比例如表所示。表 和 的混合比例 样品 的混合比例 (:)(:)(:)复合
7、水凝胶的性能测试傅里叶变换红外光谱使用红外光谱仪(德国,布 鲁 克光谱,)分析水凝胶的红外光谱。通过 压片法得到样品的傅里叶变换红外光谱()在 分辨第期安玉川,等:一种基于光交联明胶聚丙烯酰胺的神经组织工程构建物率下对每个样品在 范围内进行扫描,每个样品总共扫描了 次。溶胀率测试先将 复合水凝胶支架用天平称重(记为),再浸入 的 溶液中浸泡。分别在浸泡,后,将支架取出,吸出表面多余水分,测定此时的支架重量为,根据如下公式()()()计算出不同时间间隔的溶胀率以及溶胀平衡状态下的溶胀率。机械性能测试通过电子材料试验机(美国,公司,)测定 复合支架的应力应变曲线。在室温下,以 的恒定速率压缩样品,
8、采用变形 时的应力应变曲线斜率来计算杨氏模量,每个样品测量次取平均值。支架形貌分析用扫描电子显微镜(日本,高新公司,)分析不同混合浓度比例的复合水凝胶支架形貌。首先将复合材料支架冷冻干燥,再将支架进行喷金处理,最后在 加速电压下观察支架的微观形态。孔隙率表征首先制作不同比例的水凝胶支架各个,测量其体积;放入 溶液中浸泡至完全溶胀后测量重量记为;将水凝胶放入无水乙醇中,完全析出水分后,测量重量为;根据公式()计算出孔隙率并取平均值,其中为酒精的密度。()()()细胞活性检验在制作水凝胶支架时,将 溶液替换为 高糖培养基,同时通过培养液中的酚红指示剂来调节溶液的 值,增加材料支架富含的营养;将溶液
9、经过滤头做除菌处理,制备成无菌的水凝胶支架;将水凝胶支架放入 孔板中用培养液浸泡,去除未交联的丙烯酰胺单体和催化剂;将第三代大鼠雪旺 细 胞以 的 密度 接 种在 混合支架上,置于培养箱中培养;分别在,进行细胞活性检测。细胞活性检测实验步骤如下:首先将支架用 冲洗两次,加入活细胞染色试剂()染色孵育;用 清洗次,加入死细胞染料试剂()染色;将支架用 溶液清洗次,放置于细胞成像多功能微孔板检测系统(美国,伯腾仪器有限公司,)中观察。细胞增殖检验细胞接种过程与细胞活性实验相同。在,分别检测了 的光度值,观察细胞增殖的情况。具体操作过程如下:首先将 孔板内的培养液吸出,同时用 溶液将细胞清洗次;将配
10、置好的 染色剂加入 孔板中;将孔板重新放入培养箱中孵育;将孵育后的 染色剂移入 孔板内并除去气泡;放入细胞成像多功能微孔板检测系统中测量其吸光度。细胞形态检测将接种到支架上的细胞进行细胞骨架染色实验,观察不同比例支架上的细胞形态,统计细胞的伸长情况。具体实验步骤如下:将培养的水凝胶支架与细胞用 清洗预处理后待用;在 孔板中加入体积分数为的多聚甲醛将支架固定 ;加入 通透液通透 ;在避光条件下加入鬼闭环太染色试剂,并在室温条件下孵育 ;用 清洗后加入细胞核 染剂避光孵育 ;最后用 清洗干净,置于细胞成像多功能微孔板检测系统中拍照观察。细胞免疫检测将接种到支架上的细胞进行细胞免疫检测,观察不同比例
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