微滴式数字PCR定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用_谢志勤.pdf
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1、2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45,No.2.2023预防兽医预防兽医微滴式数字微滴式数字PCRPCR定量检测滑液囊支原体定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用方法的建立及应用谢志勤,谢芝勋*,张艳芳,范晴,谢丽基,万丽军,罗思思,李孟,张民秀,曾婷婷,黄娇玲,王盛,李丹,韦悠,李小凤,任红玉,阮志华(广西壮族自治区兽医研究所,广西兽医生物技术重点实验室,农业农村部中国-东盟(广西)跨境动物疫病防控重点实验室,广西南宁530001)摘要:为绝对定量滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),试验根据已发表的MS VlhA基因序列,针对其保守区域分别
2、设计了1对特异引物和1条探针,建立了ddPCR定量检测MS的方法,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示:建立的方法最佳引物浓度为20mol/L,最佳探针浓度为10 mol/L,最佳退火温度为54;该方法仅检测出MS毒株,不能检测出其他禽源病原,MS重组质粒标准品最低检测限为3.5拷贝/L,3个连续稀释的MS重组质粒DNA检测的变异系数均小于5%;45份病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品检测结果显示,该方法的MS阳性检出率(11.1%)高于荧光定量PCR(8.9%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测MS特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量MS提供了适合的技术手段。关键词:微滴式数字
3、PCR;定量检测;鸡滑液囊支原体中图分类号:S852.62文献标识码:A文章编号:1004-6364(2023)02-39-07收稿日期:2022-05-11;修回日期:2022-07-15基金项目:广西重点研发计划(桂科AB16380003);国家“万人计划”领军人才专项(W02060083);“广西八桂学者”专项(2019A50)作者简介:谢志勤(1965-),男,本科,研究员,主要从事畜禽疫病研究,E-mail:*通讯作者:谢芝勋(1963-),男,本科,研究员,主要从事禽病研究,E-mail:doi:10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.007Establ
4、ishment and Application of Droplet Digital PCR forQuantitative Detection of Mycoplasma synoviaeXIE Zhiqin,XIE Zhixun*,ZHANG Yanfang,FAN Qing,XIE Liji,WAN Lijun,LUO Sisi,LI Meng,ZHANG Minxiu,ZENG Tingting,HUANG Jiaoling,WANG Sheng,LI Dan,WEI You,LI Xiaofeng,REN Hongyu,RUAN Zhihua(Key Laboratory of Ch
5、ina(Guangxi)-ASEAN Cross-border Animal Disease Prevention and Control,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Guangxi Veterinary Research Institute,Nannning,Guangxi 530001)Abstract:To absolutely quantify of Mycoplasma synoviae(MS),a set of specifi
6、c oligonucleotide primers and probe were designed and synthesized to recognize the distinct genomic sequences of VlhA gene based on published sequences of MS.As established to detect MS with this primers and probe,and specificity,sensitivity and repeatability of the established method were detected.
7、The results showed that the optimizing reaction conditions of the established method were 20 mol/L of primers,10 mol/Lof probe,54 for annealing temperature.All MS strains were amplified and did not cross-react with other avian pathogens bythis method.The minimum limit for quantitative detection of M
8、S recombinant plasmid DNA was 3.5 copies/L.The coefficientsof variation were all less than 5%for three consecutive dilution MS recombinant plasmids.Forty-five samples of throat swabs,-392023年第45卷第2期China Poultry Vol.45,No.2.2023预防兽医预防兽医滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)可感染不同品种和日龄的鸡,引发鸡滑液囊支原体病。雏鸡感染MS可引起鸡
9、关节囊、腱鞘膜发炎,故又称鸡传染性滑膜炎病,可导致鸡单侧或双侧脚胫跗跖跗关节肿大,进一步引发鸡内脏实质器官发生肿大,生长发育迟缓,淘汰率高1。种鸡和蛋鸡感染 MS 可引发呼吸道症状,生产性能下降2-3。MS感染呈世界性流行4-6,鸡可常年感染,冬春季节发病较多。鸡群感染MS后很难清除7,导致机体抵抗力下降,容易继发其他病原感染,且一旦发生混合感染,会加重病情,导致死亡率大大增加,并造成极大的经济损失。目前防控MS感染采用的是疫苗免疫和药物防治两种途径8-9,但由于各种因素的影响,MS感染依然在鸡群中时有发生。及时准确诊断是防控MS感染的关键措施之一,实验室诊断方法如分离鉴定10、PCR11-1
10、2、荧光定量PCR13-14、LAMP15等在MS的临床诊断中存在一定不足,如分离鉴定方法繁琐,诊断周期长;普通PCR检测敏感性虽达1 pg/L DNA,但需要进行电泳,费时且易增加污染风险;荧光定量PCR检测的敏感性达20拷贝/L,但需要通过内参来建立标准曲线及扩增的Ct值来计算拷贝数,常受内参的稳定性及Ct值的影响,且只能实现相对定量检测;LAMP检测敏感性达100拷贝/L,但操作中易受污染,假阳性较多。微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)是近几年发展起来的技术,其方法是通过油包水(反应液)将反应液分为数万个独立的纳米级微滴,在每个微滴完成PCR反应,完成
11、后通过微滴读取仪对逐个微滴进行检测记录,软件自动读取统计带荧光(阳性,蓝色)与未带荧光(阴性,黑色)微滴个数与比例,并自动计算出拷贝数,从而实现对核酸的绝对定量。目前该技术在很多领域包括动物疫病病原检测诊断方面已有成功的应用,如原霖等16建立的ddPCR方法能检测到0.8拷贝/L的非洲猪瘟病毒,谭建锡等17采用微滴数字PCR方法成功检测到4.7拷贝/L的H1亚型猪流感病毒。在MS含量低的感染早期确诊是防控MS感染的关键措施之一,但需要建立一种敏感度高的绝对定量检测方法,以便及时确诊。为解决这一问题,本研究建立了ddPCR检测MS方法,为早期诊断MS感染提供检测工具。1材料与方法1.1试验毒株滑
12、液囊支原体(MS)毒株(K1415、28、FMT、PMS122)、鸡毒支原体(MG)毒株(S6、K2221、A5969)、禽衣阿华支原体(MI)K-1805株由美国康涅狄格大学Mazhar I.Khan教授惠赠。禽偏肺病毒(APV)MN-10株由美国宾夕法尼亚州立大学Huagang Lu教授惠赠;禽传染性支气管炎病毒(IBV)Mass 41株、禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)BJ株、新城疫病毒(NDV)La Sota株、禽呼肠孤病毒(ARV)S1133 株、H9N2 亚型禽流感病毒(H9N2AIV)066C株由本实验室保存18;鸡白痢沙门氏菌(SP)C79-13株和大肠杆菌(E.coli)O2
13、株购自中国国家兽医微生物菌株保藏管理中心。1.2主要试剂Supermix for Probe ddPCR(No dUTP)、dropletgeneration oil for Probes ddPCR、Droplet Reader Oil、DG8 Cartridges、DG8 gaskets、Pierceable Foil HeatSeal购自美国Bio-Rad公司;EasyPure Virual DNA/RNA Kit、Gel Extration Kit购自北京全式金生物技术有限公司;TIANamp Bacteria DNA kit购自天根生化科技(北京)有限公司;RT-PCR扩增试剂盒、P
14、remix Ex Taq 试 剂 盒、100 bp DNA Ladder、pMD18-T、大肠杆菌DH5、T4连接试剂盒、凝胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。1.3主要仪器微滴生成仪(QX200 Droplet generator)、热封仪(PX1)、微滴数字读取仪(QX200 Droplet Reader)、梯度PCR扩增仪(T-100)购自美国Bio-Rad公司;荧光 PCR 仪(quantStudio 5)、分光光度计(Nanodrop 2000)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。1.4引物设计与合成根据已发表的MS VlhA基因(GenBank登录
15、号:MT241266.1)序列,利用在线软件(https:/bioinfo.lungs and joint capsules collected from sick chickens were tested,the the positive detection rate of the established ddPCR(11.1%)was higher than that of fluorescent quantitative PCR(8.9%).Its indicated that the ddPCR method had strong specificity,high sensitivit
16、y and good repeatability for MS detection,which supplied a suitable method for absolute quantitation of MS.Key words:droplet digital PCR(ddPCR);quantitative detection;Mycoplasma synoviae-402023年第45卷第2期China Poultry Vol.45,No.2.2023ut.ee/primer3-0.4.0/)设计ddPCR特异性引物和探针,并在线进行BLAST分析,在探针序列的5端添加FAM荧光基团,3
17、端添加BHQ1淬灭基团。引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并经HPLC纯化,引物和探针序列见表1。1.5核酸的提取按 EasyPure Virual DNA/RNA 试剂盒说明书提取 APV、IBV、ILTV、NDV、ARV、H9N2 AIV 的DNA/RNA,按TIANamp Bacteria DNA kit说明书提取MS、MG、MI、SP及E.coli的DNA,提取的DNA/RNA直接用于扩增或于-80 保存备用。1.6标准品模板的制备用MS F/MS R引物扩增MS K1415 VlhA基因,扩增产物经电泳后,将含大小约195 bp的目的片段回收、纯化,与pMD18-T载体
18、连接并转染到大肠杆菌DH5。转染后的质粒DNA经PCR鉴定并送宝生物工程(大连)有限公司测序,测序正确的质粒DNA用分光光度仪测定OD260nm/OD280nm值,计算拷贝数,所得的重组质粒DNA即为标准品,小管分装并保存于-80 备用。1.7ddPCR反应的建立及条件优化ddPCR反应体系为20 L:2Supermix 10 L,540 mol/L 的 MS F/MS R 引物各 1 L,2.540 mol/L的MS Pro 1 L,标准品模板2 L,加灭菌ddH2O补足至20 L。在微滴发生卡的第二排孔分别加入上述反应液20 L,第三排孔每孔加入微滴生成油70 L,盖上衬垫,置微滴生成仪上
19、自动生成微滴于第一排孔。吸取生成的微滴至96孔板内,加铝膜置PX1热封仪上,程序设置为180 10 s进行封膜。封膜的96孔板放入PCR扩增仪上进行扩增,反应程序:95 10 min;94 30 s,退火温度设置5160 1 min(2/s),共进行40个循环;98 10 min;4 结束。反应结束后将96孔板置QX200 Droplet Reader上读取信号并进行数据分析。分别设置MS F/MS R引物浓度 MS Pro浓度为5 2.5、10 5、15 10、20 10、25 15、30 20、40 40、40 0,退火温度为 51、53、54、55、56、57、58、60 共8个不同梯度
20、进行ddPCR反应条件优化。1.8ddPCR特异性测定将 H9N2 AIV、IBV、NDV、APV、ARV 的 RNA反转录为 cDNA,然后与 MS K1415、MS 28、MSFMT、MS PMS122、MG S6、MG K2221、MG A5969、MI、ILTV、SP、E.coli的DNA一起分别加入优化的ddPCR反应体系中进行特异性检测。1.9ddPCR敏感性及重复性测定MS重组质粒标准品测定浓度后以10倍梯度稀释,稀释范围在10-310-10,每个稀释度取2 L加入已优化好的ddPCR反应中,以检测ddPCR反应的敏感性。同时采用相同的引物探针以及同一模板浓度进行荧光定量PCR检
21、测,反应体系25 L:Premix Ex Taq 12.5 L,20 mol/L MS F/MS R各1 L,10 mol/L MS Pro 1 L,标准品模板2 L,10 mol/L ROX 1 L,灭菌ddH2O 6.5 L。扩增程序为:95 10 min;95 15 s,54 1 min(2/s),40个循环;98 10 min;4 结束,比较两种方法的敏感性。取10-510-7三个连续稀释的质粒标准品为模板进行3次重复试验,以检测ddPCR的重复性。扩增荧光强度在4 500以下(黑色和灰色)的微滴数判定为阴性,荧光强度在4 500以上(蓝色)的微滴数判定为阳性。1.10临床样品检测20
22、21年5月至2022年2月,广西5个不同鸡场的20日龄左右良凤花鸡雏鸡出现精神不振,伴随有轻微的呼吸道症状,个别雏鸡单侧或双侧脚关节外侧出现肿大,走路困难,食欲减少,少部分感染雏鸡出现死亡现象。采集上述病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品共计45份。分别取5 g肺脏及关节囊约按1 8加入无血清的MDEM培养基进行研磨,喉拭子加入 2 mL 无血清的 MDEM 培养基,-70 反复冻融3次,4 000 r/min离心5 min,取上清,14 000 r/min离心10 min,去上清,按TIANampBacteria DNA kit 说明书步骤提取沉淀中的总DNA。用建立的ddPCR方法进行检测,同时采
23、用相同的VlhA基因为靶表基因,参考Huang等13建立的荧光定量PCR进行检测,荧光定量PCR引物及探针序列如下:MS-F1:5-ATAGCAATTTCATGTGGTGATCAA-3,MS-R1:5-TGGATTTGGGTTTTGAGGATTA-3,MS-p1:5-ROX-CAGCACCTGA表1所用的引物和探针序列引物和探针MS FMS RMS Pro序列(53)GCCATTGCTCCTGCTGTTATAGCAGCCTCTACAGGGTCAAFAM-AACCCAAATCCAGGAAACC-BHQ1位置7292266246164184产物大小/bp195195195预防兽医预防兽医-4120
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