嗜热紫硫细菌RuBisCO的冷冻电镜结构研究_常圣海.pdf
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1、第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ,文章编号:()嗜热紫硫细菌 的冷冻电镜结构研究常圣海,张 兴,陈景华(浙江大学冷冻电镜中心,浙江 杭州;浙江大学医学院附属邵逸夫医院,浙江 杭州;浙江大学生命科学学院,浙江 杭州)摘 要 ,二磷酸核酮糖羧化酶 加氧酶(,)能够催化光合作用暗反应过程中 的同化过程,完成生物圈中 的碳固定。然而 的催化效率极低,每个 全酶每秒钟只能催化 个 分子的转化,高温环境下,高等植物中 的催化活性会更低。全球暖化环境下,获取高温环境下具有较高催化活性的 突变体,既能增加作物产量,又可固定更多,减缓全球暖化速度。本研究利用冷冻电镜技术获取了嗜热紫硫细菌 的精细三
2、维结构,并分析其与其他物种 结构上的异同,对设计高温环境下具有较高催化活性的 突变体提供了基础。关键词 ;嗜热紫硫细菌;冷冻电镜中图分类号:;文献标识码:收稿日期:;修订日期:基金项目:浙江大学实验技术研究项目();国家自然科学青年基金资助项目();国家重点研发计划项目(,)作者简介:常圣海(),男(汉族),河南人,助理研究员:通讯作者:陈景华(),男(汉族),陕西人,研究员:光合作用是地球上最重要的生化过程,向大多数生物提供物质基础和能量来源。光合作用包括光反应和暗反应两个阶段,其中,在暗反应过程中,催化五碳糖底物,二磷酸核酮糖()羧化生成两个 磷酸甘油酸分子,将大气中的 转换有机碳,完成碳
3、的固定。鉴于 的重要作用,其结构和功能已经被广泛和深入的研究。已知的 包含四种类型,其中 型为自然界中丰度最高,广泛分布在光合细菌和高等植物中,约占生物圈中蛋白干重的 以上,催化绝大部分的碳固定过程。型 是由 个大亚基()和 个小亚基()组成的复合体。该复合体呈 对称,由四个 二聚体围绕四次轴排列,两端各有四个,其合成和组装 需 要 一 系 列 的 分 子 伴 侣,包 括 和 积累因子()。二聚体界面形成两个催化口袋,全酶包含 个催化口袋;不直接参加催化反应,但能够调控全酶的催化活性。天然 的催化效率极其低下,是光合作用固定 的限速步骤。对 进行工程化改造,提高其固碳效率和反应特异性,对于提高
4、农业作物产量和实现碳中和目标均具有重要意义。高等植物中,环境温度提高,的催化活性显著降低。随着全球暖化效应的日趋严重,设计和筛选高温环境下具有高催化效率的 突变体日趋重要。目前尚无嗜热光合细菌 的超高分辨结构报道,只是在绿硫细菌中获得了 的结构,不能 固 定。基于此,本工作拟通过获取高热环境生物中 结构,以期望揭示其高温环境下独特的工作机制。嗜热型紫硫细菌 ()分离于日本长野县的温泉中,是一种非产氧的光合细菌,该细菌的最佳生长温度约为。获取 的 高分辨结构,对于进一步设计高温环境下具有高催化活性 具有重要的借鉴意义。本研 究 利 用 冷 冻 电 镜 技 术 对 紫 硫 细 菌 的 进行三维重构
5、,并与其他物种的 进行比较,探索高温环境下 催化碳固定的结构基础和分子机制。材料与方法 的纯化 细胞在 培养箱中厌氧生长 天。收集 细胞,离心,沉淀用 缓冲液(,;电子显微学报 第 卷)重悬,加入 混合后置冰上预冷 。将样品置冰上使用超声波破碎仪进行菌体破碎。破碎浆液 ,离心 ,弃沉淀,上清 ,超速离心 。超速离心后取上清,用 的滤膜过滤后进行阴离子交换柱层析(蛋白纯化系统)。柱层析填料为 (),样品上样后先用 缓冲液洗脱 个柱体积,再使用 缓冲液梯度洗脱 个柱体积,收集合并 缓冲液洗脱下来的样品,使用 超滤管对样品进行浓缩(,)。先后用 和的硫酸铵沉淀样品,将 硫酸铵沉淀的样品用少量 缓冲液
6、(,)重悬,上样进行第二次阴离子交换柱层析(蛋 白 纯 化 系 统),使 用 缓冲液梯度洗脱 个柱体积。收集第一个洗脱峰,样品进行浓缩后进一步采用凝胶过滤层析分离。凝胶过滤层析柱型号为 (公 司),柱 体 积 ,缓 冲 液 为,;。收 集 主 峰 样 品,使 用 超 滤 管()超滤浓缩(,)即可得到高纯度 样品。冷冻样品制备 ()载网的处理:使用()对载网(目)进行辉光处理,使载网表面亲水化,以便样品能均匀的铺在载网表面,辉光电流强度设置为 ,辉光处理时间为。()设置 (赛默飞)冻样参数:温度为 ,相对湿度为,为,为 ;取 浓度为 的标准蛋白样品加到载网上,按照设置好的 冻样流程操作,最后将载
7、网快速冷冻在液态乙烷里。数据收集 ()设备:冷冻电镜(,赛默飞);直接电子探测器(,)。()自动收集软件:。()收集模式:放大倍数为 倍,对应像素大小为 ;单电子计数模式,电子束斑强度为 ,曝光 ,总剂量为 ;每张数据包含 帧,每帧曝光时间为 。数据处理 使用 程序对每张图片进行漂移矫正,使用 对矫正后的图片进行衬度传递函数的测定。使用 和 软件完成后续的数据处理。在 中使用 在 张照片中挑出 个颗粒,然后使用 进行第一次 分类,筛选得到 个颗粒;接着使用 对这些颗粒进行额外的两次 分类,最终得到 个颗粒。使用这些颗粒,加上 对称轴,得到 分辨率的 三维重构结果,具体流程如图 所示。模型搭建
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