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山梨猕猴桃根提取物抗肿瘤活性研究
【摘要】 　　目的 从山梨猕猴桃根中筛选抗肿瘤活性成分。方法采用MTT法、细胞集落形成法筛选山梨猕猴桃根提取物的抗肿瘤活性成分。结果山梨猕猴桃根提取物用集落形成法R6，R8对胃癌细胞株SGC7901、白血病细胞株L1210、神经性肿瘤细胞株NG108-15、肝癌细胞株Bele7404的增殖有抑制作用；用MTT法对NG108-15，SGC7901的增殖有抑制作用。山梨猕猴桃根两种提取物对脾淋巴细胞没有免疫毒性。结论山梨猕猴桃根提物R6，R8有抗肿瘤活性。
【关键词】 山梨猕猴桃根提取物； 抗肿瘤活性成分筛选； 肿瘤细胞株
　　Abstract：ObjectiveTo screen the anti-tumor active components extracted from roots of A. rufa Planch. MethodsThe anti-tumor activity of the components extracted from roots of A. rufa Planch was determined by MTT and clone cells ,R8 extracted from roots of A. rufa Planch could restrain the cell proliferation in the stomach carcinoma SGC7901, lymphocytic leukemia L1210, mouse neuroblastomax rat gliom hybrid NG108-15, and human hepatocellular carcinoma Bele7404 cell strain by clone cells and restrain the cell SGC7901, NG108-15 cell strain by MTT. 2 kinds of extracts (R6, R8) had no immunity toxicity to the lymphocyte in spleen. ConclusionThe results show that R6,R8 extracted from roots of A. rufa Planch have the anti-tumor activity.
　　Key words：The active components extracted from Roots of A. rufa Planch; Screening of the anti-tumor activie components； Tumor cell strain
山梨猕猴桃根为猕猴桃科猕猴桃植物Actinidia rufa Planch ex Miq.的根或根皮，产于广西贫困山区德保、龙胜等县，一直作为民间中草药使用，其根经药理实验证明，具有抗癌活性［1］。本课题组成员张凤芬等［2］对山梨猕猴桃根醇提物及醇提物的正丁醇提取物的体外抗肿瘤活性进行了研究，确定正丁醇提取物有抗肿瘤活性，我们对正丁醇部位用柱层析分离等方法得37种样品，其中31种粗提物已在另一篇文章介绍，本文就其中6种提取物，用集落形成法研究其对白血病细胞株L1210、人胃癌细胞株SGC7901、神经性肿瘤细胞株、人肝癌细胞株Hela7404细胞增殖的抑制作用；用MTT法研究提取物对SGC7901和NG108-15细胞的增殖的抑制作用，并对有抗肿瘤活性的提取物对正常小鼠脾淋巴细胞进行细胞毒实验。现报道如下。
　　1 器材1 山梨猕猴桃根提取物为山梨猕猴桃根提取的乙醇浸膏的正丁醇溶解部分通过柱层析分离等方法得6种单体(以下以R1～R13或代试物表示) 。用蒸馏水溶解后无菌过滤备用。2 肿瘤细胞株白血病细胞株L1210、人胃癌细胞株SGC7901、神经肿瘤细胞株NG108 -15 等均购自上海细胞生物研究所细胞库,人肝癌细胞株Hela7404由广西医科大学药理教研室提供。3 试剂MTT(四甲基噻唑蓝) 为德国Sigma公司产品，批号020609；FBS(胚胎牛血清) 为美国Hyclone公司产品，批号0405；RPMI1640和DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，批号1120708 和0311；Trypsin(胰蛋白酶)由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号200503；DMSO(二甲基亚砜)由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号20030526；Wright’s stain(瑞氏色素)购自上海三爱思试剂有限公司，批号20011026；Giemsa’s stain(吉氏染色素)购自上海试剂三厂，批号20000324。ConA(刀豆蛋白A) Sigma(进口分装) 购自广州达新生物技术开发有限公司 批号：0504。LPS(大肠杆菌脂多糖) Sigma(进口分装) 购自广州达新生物技术开发有限公司，批号0406。4 仪器
　　CO2 培养箱(Thermo Forma)，美国产，型号381；倒置显微镜(Olympus)，日本产，型号CK40；酶标仪(Biocell)，澳地利产，型号Sunrise。
　　2 方法［3］
　　MTT 法测定
　　在96孔培养板中每孔加入200μl10%FBS RPMI1640培养液，置CO2培养箱中培养24 h后，实验组分别加入样品，对照组则加入等体积溶剂，每组4孔。置CO2培养箱培养5 d后，弃去上清液，加入200 μl/孔新鲜配制的含 mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4 h。弃上清液，加入200 μl，振荡混匀后，用酶标仪测定OD值。重复4次。计算结果。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:

　　肿瘤细胞生长抑制率=×%
　　集落形成法
　　采用SGC 7901，NG 108-15，Bele 7404，L1210四株肿瘤细胞株。其中L1210用半固体软琼脂集落培养法，取35 mm培养皿，4个为一组，实验组分别加入代试物，对照组加入等体积的培养液，进行相应的处理。盖上培养皿盖，置37℃10%CO2培养箱培养7 d，在16×的显微镜下计数直径大于75 μm(50个细胞以上)的集落。其余3种肿瘤细胞株用贴壁法，用10% FBS RPMI1640 培养液配成含500个/ ml 细胞悬液，每皿加2 ml。实验组分别加入代试物，对照组加入等体积的培养液。置37℃10%CO2培养箱培养7 d，弃去培养液，用瑞氏-吉姆萨染色后计数含50个细胞以上的细胞集落数。重复4次。按下式计算集落形成率
　　集落形成率=克隆数/接种细胞数×100%［4］
　　对小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的影响［5］
　　脾脏淋巴细胞的制备颈椎脱臼处死昆明种小鼠，用75%的酒精浸泡5 min，无菌操作取出脾脏，在RPMI 1640液中将脾脏剪碎成1～2 mm3小块，用%的胰酶37℃消化制成单个细胞悬液，用含10%小牛血清RPMI 1640完全培养基制成3×106/ml的脾细胞悬液。
　　脾脏淋巴细胞增殖活性的检测
　　将悬液以160 μl/孔加入培养板中。在脾细胞的培养板中分别加入T、B淋巴细胞增殖的刺激因子Con A和LPS，每孔20 μl。待测样品每孔加20 μl，每组4平行孔，培养板在37℃含5%CO2的培养箱中孵育48 h后，用MTT法测定T、B淋巴细胞增殖的活细胞数。MTT测定方法同。
　　3 结果
　　MTT法
　　本实验是在本课题组成员张凤芬等的实验基础上，对山梨猕猴桃根正丁醇提取物进行再提取，得6种单体。在～1μg/ml的范围内，对SGC7901，NG108-15肿瘤细胞株增殖的影响，山梨猕猴桃根6种提取物对SGC7901，NG108-15细胞增殖的影响见表1。表1 山梨猕猴桃根6种单体对SGC7901、NG108-15细胞抑制的影响
从表1可以看出，在～1 μg/ml的范围内，R6，R8两种单体对SGC7901肿瘤细胞株的抑制率均大于50％且IC50小于30 μg/ml，抑制率分别为，，IC50分别为， μg/ml，有强的细胞毒性；其余4种对SGC7901肿瘤细胞株的抑制率均小于50％且IC50大于30 μg/ml，有较弱的细胞毒性。R6、R8两种单体对NG108-15肿瘤细胞株的抑制率均大于50％且IC50小于30 μg/ml，抑制率分别为，，IC50分别为22， μg/ml，有强的细胞毒性；其余4种对NG108-15肿瘤细胞株的抑制率均小于50％且IC50大于30 μg/ml，有较弱的细胞毒性。
　　集落形成法实验中，先选取山梨猕猴桃根两种正丁醇再提取物进行再筛，为进一步验证，对其中增殖抑制率大于50％，IC50小于30 μg/ml且对两个细胞株有作用的山梨猕猴桃根2单体，用4株肿瘤细胞株NG108-15，Bele7404，L1210，SGC7901用集落形成法进行再筛选。结果见表2～3。表2 两种单体对4种肿瘤细胞增殖的集落形成率的影响 表3 两种单体对4种肿瘤细胞增殖的抑制率
从表2～3可以看出，山梨猕猴桃根提取物山R6，R8对SGC7901细胞集落形成率分别为，，与阴性对照组比较，有显着性差异；对NG108-15细胞集落形成率分别为，，与阴性对照组比较，有显着性差异；对Bele7404细胞集落形成率分别为，，与阴性对照组比较，有显着性差异；对L1210细胞集落形成率分别为，，与阴性对照组比较，有显着性差异。其中R6对4株肿瘤细胞的增殖抑制率都大于50%；R8对SGC7901增殖抑制率为外，对其余3株肿瘤细胞的增殖抑制率均大于50%。集落形成法的结果显示，各组肿瘤细胞的集落形成率跟阴性对照组相比较，表明山梨猕猴桃根正丁醇的再提物对SGC7901，NG108-15，Bele7404，L1210肿瘤细胞株集落形成有抑制作用。所得结果与MTT法结果相吻合。
　　2种单体对小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖反应的影响
　　从6种单体中筛选出对4种肿瘤细胞株增殖的抑制的作用较强、抑瘤谱较广的R6，R8，并对它们进行对正常免疫细胞增殖影响的测试。将小鼠脾脏细胞用有丝分裂原ConA、LPS刺激后，分别加入不同浓度的R6，R8，检测其对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响。结果见表4。表4 山梨猕猴桃根两种单体对脾细胞增殖的影响
从表4可以看出，山梨猕猴桃根提取物R6、R8对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖IC50分别为， μg/ml，抑制率均小于50％。山梨猕猴桃根提取物R6，R8对小鼠脾脏B淋巴细胞增殖IC50分别为， μg/ml，抑制率均小于50％。
　　4 讨论
广西是我国中草药资源和品种最丰富的省份之一。据民间药方和文献记载［6］，广西一些特产及珍稀中草药具有抗癌功效，如猕猴桃根常以单方形式用于治疗鼻咽癌、骨癌、肝癌、乳腺癌等多种癌症疾病。因此，有必要对地方特产的具有抗癌活性的中草药植物，在系统的抗癌药理研究的配合下，开展有效活性成分的研究。在筛选思路上结合美国国立癌症研究院针对疾病的筛选思路和模式，先用较为敏感的细胞株进行初筛，继而对初筛中活性较强的提取物用多株细胞株进行扩大筛选，最后用小鼠脾淋巴细胞对抗肿瘤活性强、抗瘤谱广的提取物进行了免疫毒性测试。本研究对活性化合物的筛选时，也对其免疫毒性进行评价。刀豆蛋白A (ConA)主要是作用于T淋巴细胞引起细胞增殖转化,而大肠杆菌脂多糖(LPS)主要引起B淋巴细胞的活化［7］。本研究通过用ConA，LPS诱导脾T，B淋巴细胞的增殖对扩大筛选中抗肿瘤活性高，抗瘤谱广的R6，R8进行检测。结果发现两种提取物在 μg/μl的浓度下，对脾T、B淋巴细胞的增殖IC50均大于30 μg/ml，增殖抑制率均小于50％。提示其对正常小鼠脾淋巴细胞毒性小。MTT法对肿瘤细胞增殖抑制率大于50％，且IC50小于30 μg/ml，集落形成法对四种肿瘤细胞株都有抑制作用，提示R6，R8在抗白血病、胃癌、肝癌、神经性肿瘤方面可能具有较高的研究价值，可进一步深入研究。
【参考文献】
　　［1］钟振国，张凤芬，甄汉深，等.山梨猕猴桃根提取物抗肿瘤作用的实验研究［J］.中医药学刊，2004，22：1075.
　　［2］张凤芬，钟振国，张雯艳，等.山梨猕猴桃根提取物的体外抗肿瘤活性研究［J］.中医药学刊，2005，23：261.
　　［3］张均田.现代药理实验方法，上册［M］.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：818.
　　［4］Bowden R. D., Buckwalter , McBride , et al. Tail profile: a more accurate system for analyzing DNA damage using the Comet assay［J］.Mutat Res, 2003, 537(1)：1.
　　［5］冯丰,薛彬,张铣. 镉致脾淋巴细胞功能抑制与细胞凋亡的关系［J］.中华预防医学杂志, 2001, 35(1): 44.
　　［6］江苏新医学院.中药大辞典，上海：上海人民出版社，1977：2210，2459.
　　［7］冯丰,薛彬,张铣.镉致脾淋巴细胞功能抑制与细胞凋亡的关系［J］.中华预防医学杂志, 2001, 35(1): 44.