一株降解园林绿化废弃物的毛...鉴定与固体产酶发酵条件优化_徐东.pdf
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1、第 7 卷第 1 期高原农业Vol.7 No.12023 年 2 月Journal of PlateauAgricultureFeb.2023收稿日期:2022-08-03作者简介:徐东(1995-),男,汉族,四川德阳人,硕士生。研究方向:园林废弃物资源化利用。通信作者:何建清(1971-),女,汉族,四川南充人,教授,硕导。研究方向:微生物资源与微生物肥料。基金项目:西藏自治区重点科技项目(XZ202001ZY0019N);国家自然科学基金项目(31560001);西藏农牧学院研究生创新计划项目(YJS2022-49;YJS2022-45)。一株降解园林绿化废弃物的毛头鬼伞的鉴定与固体产酶
2、发酵条件优化徐 东何建清*葛彦宏刘海鑫韩 振刘林峰(西藏农牧学院 植物科学学院,西藏林芝 860000)摘要 本研究以试验前期筛选到的一株野生产木质纤维素酶活性的食用菌为材料,根据形态学与rDNA-ITS 序列对该食用菌进行鉴定。以园林废弃物粉为主要原料,采用单因素试验及正交试验对固体产酶条件进行优化。结果表明:试验食用菌菌株为毛头鬼伞 Coprinus comatus。单因素试验证明:氮源、初始 pH、温度和接种量为降解木质纤维素的显著影响因子,正交试验确定毛头鬼伞产羧甲基纤维素酶活性最优条件为:pH 为 7、温度25、接种量 10%、碳氮比为 15:1。该研究结果为园林废弃物木质纤维素的降
3、解提供了良好的菌种资源,同时也为后续园林废弃物木质纤维素降解方面的研究积累了相关数据。关键词 毛头鬼伞;固体发酵;木质纤维素;园林废弃物;酶活性中图分类号:S646文献标识码:A文章编号:2096-4781(2023)01-0050-09DOI:10.19707/ki.jpa.2023.01.007Identification of a Coprinus comatusDegrading Landscaping Wasteand Optimization of Enzymatic Fermentation ConditionsXU Dong,HE Jianqing*,GE Yanhong,LI
4、U Hanxin,HAN Zhen,LIU Linfeng(Plant Science College,Tibet Agriculture&Animal Husbandry University;Nyingchi Tibet,860000 China)Abstract:In this study,a wild lignocellulase producing edible fungus selected in the early stageof the experiment was identified according to the combination of morphology an
5、d ITS biology.Using garden waste powder as the main raw material,solid single factor test and orthogonal testwere used to optimize the condition of enzyme production.The results showed that the strainwas preliminarily identified as Coprinus comatus by morphological and molecular biologicalcharacteri
6、stics.Single factor test showed that nitrogen source,initial pH,temperature andinoculum size were significant influencing factors for lignocellulose degradation.Orthogonaltest determined that the optimal conditions for carboxymethyl cellulase production were pH 7,temperature 25,inoculum size 10%and
7、C/N ratio 15:1.The research results provided a goodstrain resource for the degradation of lignocellulose from garden waste,and also accumulaterelevant data for the subsequent research on lignocellulose from garden waste.Key words:Coprinus comatus,solid fermentation,lignocellulose,garden waste,enzyme
8、activity随着中国经济的快速发展,人们对城市生态环境的要求越来越高。伴随着城市绿地面积大幅度地第 1 期徐东等:“一株降解园林绿化废弃物的毛头鬼伞的鉴定与固体产酶发酵条件优化”51增加,园林废弃物的产生量骤增1,2。我国每年产出约1400104t的园林废弃物3,已成为城市固废中除污泥外的又一大污染源。因此,如何有效转化和利用园林废弃物以减少对环境的危害也是当前关注的问题。在园林废弃物的处理方法中,生物堆肥法因其能耗低、降解率高、对环境友好等优点而被广泛应用4。但由于园林废弃物富含纤维素、半纤维素和木质素等难降解的物质,致使堆肥周期过长5。将微生物菌剂接种于堆肥中对于木质纤维素的降解有促进
9、作用,也被认为是可以加速堆肥进程的有效手段6-7。目前,白腐菌被认为是降解木质素最有效的一类真菌微生物,在降解过程中白腐菌可以把木质素彻底分解为能够参与碳素循环的二氧化碳和水8。目前,研究较多的白腐菌有黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),杂 色 云 芝(Coriolus versicolor),虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、乳白耙菌(Irpex lacteus)等9。白腐菌既可以降解阔叶木、针叶木还可以降解草本植物地上部分。使其在工业、农业、环境保护和资源开发上具有极大
10、的应用潜力。毛头鬼伞(Coprinus comatus)又名鸡腿菇,是担子菌门真菌10,是一种对木质素没有选择性的白腐菌,其能产生大量的木质素降解酶降解秸秆中外层的木质素,促进秸秆内部纤维素和半纤维素的降解,因而可充分利用秸秆中的木质纤维素11,12。毛头鬼伞能有效利用秸秆中木质纤维素转化为小分子物质,再参与其他合成反应13。目前国内外对毛头鬼伞降解农作物秸秆研究较多14,15,鲜见毛头鬼伞在园林废弃物降解方面的研究。鉴于此,本研究以实验室前期试验筛选到 1 株在园林绿化废弃物基质上长势良好的毛头鬼伞为研究对象16,对其进行形态学、分子生物学鉴定,以菌丝固体发酵产纤维素酶和木质素过氧化物酶活性
11、为评价指标,对影响毛头鬼伞产酶活性的各个单因素进行研究,并在单因素试验基础上采用正交试验分析法优化其固体发酵工艺,以期为提高园林废弃物降解率提供优质的菌株资源。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株野生毛头鬼伞采集自西藏农牧学院校园草坪,经组织分离法获得纯菌株并编号为 MT01,保存于西藏农牧学院真菌实验室。1.1.2 园林绿化废弃物材料试验所用的园林绿化废弃物取自西藏农牧学院校园草坪草和树叶的混合物,收集园林绿化废弃物,干燥,粉粹,过筛,备用。1.1.3 培养基PDA 培养基:用于菌种分离与保藏、形态特征观察、菌种培养,配方见参考文献17。PD 液体培养基:PDA不加琼脂,用于菌株的
12、扩繁。固体培养基:园林废弃物粉 20g+60 mLPD 培养液+2 g尿素,用于固体发酵产酶试验。1.2 试验方法1.2.1 菌种鉴定形态学鉴定:依据子实体的外部形态,菌盖大小、颜色及菌盖上附属物,菌褶形态,菌缘结构,是否有菌托等,通过形态观察初步确定到属。菌株置常温下复苏,3 d后分别转种于 PDA 培养基,置于27恒温箱培养10 d,观察菌落的生长情况18。分子生物学鉴定:挑取生长良好的菌丝,采用CTAB 法提取基因组 DNA,用琼脂糖凝胶进行电泳检测回收 PCR 产物,然后将产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果用 BLAST52高原农业2023 年第 1 期程序与Gen
13、Bank数据库中已知ITS序列进行相似性比较分析,并用 MEGA5.0 的 Neighbor-Joining 法构建系统发育树。1.2.2 木质纤维素降解酶活性测定1.2.2.1 粗酶液的制备为测定该菌株对园林废弃物的降解能力,将菌种接种于固体培养基28静止培养9 d,从培养3 d后开始每天取样,连续9 d。取1 g固体发酵物按 1:10 添加蒸馏水,混合均匀,在10 000 r/min 条件下离心10 min 制备粗酶液。1.2.2.2 酶活性的测定木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase)酶活的测 定 采 用 藜 芦 醇 法,羧 甲 基 纤 维 素 酶(Carboxymethy
14、l cellulase)的测定采用 DNS 法,具体测定方法及酶活力定义参照文献19和土壤酶及其研究法20。1.2.3 单因素试验1.2.3.1 不同氮源对菌株 MT01 产酶的影响将母种接入盛放有 PD 培养基的三角瓶中,置于28,140 r/min,振荡培养7 d,待形成均一菌丝球后,按 6%接种量接种于固体发酵培养基中,在1.1.3 固体培养基配方的基础上,氮源分别设置牛粪、羊粪、尿素、硝酸铵 4 个处理,每一个处理设 3 次重复,从培养3 d后开始每天取样,连续7 d。采用1.2.2.2方法测定纤维素酶和木质素过氧化物酶含量。1.2.3.2 不同温度对菌株 MT01 产酶的影响设置温度
15、梯度为15、20、25、30、35,每一个处理设 3 次重复,测量方法同上。1.2.3.3 不同 pH 对菌株 MT01 产酶的影响设置产酶发酵培养基 pH 梯度为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。接菌后于28恒温箱中静止培养,每一个处理设 3 次重复。酶活性测量方法同上。1.2.3.4 不同 C/N 对菌株 MT01 产酶的影响以尿素作为基本氮源进行 C/N 试验,加入不同量尿素以调节培养基的 C/N。分别设 C/N 为 10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 等 5 个处理,每一个处理设3 次重复。酶活性测量方法同上。1.2.2.5 初始接菌量对菌株 MT01 产酶的影响
16、在上述优化培养基中,分别接种含量为 2%、4%、6%、8%、10%的种子液。28静止培养,每一个处理设 3 次重复。酶活性测量方法同上。1.2.2.6 不同废弃物粒径对菌株 MT01 产酶的影响将园林废弃物分别过1 cm、2 cm、3 cm筛,按6%接种量接种于 C/N 为 25:1、pH 值为 7、温度28恒温箱中静止培养,每一个处理设 3 次重复。酶活性测量方法同上。1.2.4 培养条件正交优化试验通过预实验选取对产酶影响较大的 4 个因素做正交实验,分别为:温度、pH、C/N、接种量。设计正交实验,以毛头鬼伞发酵固体废弃物的 CMC酶活作为产酶能力的指标,采用 L9(34)正交表设计实验
17、。2 结果与讨论2.1 菌株 MT01 鉴定2.1.1 形态特征菌株 MT01 子实体单生或丛生,呈棒槌状。菌盖初期成圆柱形,与菌柄结合紧密,菌柄向下逐渐增粗,状似倒立的鸡腿(图 1A),菌盖白色,初光滑,后期表皮开裂,形成平状鳞片。鳞片初白色,后渐变为淡锈色,成熟时上翘、翻卷。菌盖直径为3.05.0 cm,高 9.011.0 cm。菌肉白色,较薄。菌柄白色,有丝状光泽,纤维质,长 17.030.0 cm,粗 1.02.5 cm,上细下粗,柄中空。菌环白色,膜质,成熟时易脱落,菌褶密,较宽,离生,初白色,担孢子形成后成黑色。MT01 菌株在 PDA 培养基中表现为菌落平展,白色或灰白色,气生菌
18、丝不发达,前期绒毛状,细密,整齐,生长较快,后期则由绒第 1 期徐东等:“一株降解园林绿化废弃物的毛头鬼伞的鉴定与固体产酶发酵条件优化”53毛状转变为线状,菌丝致密,呈匍匐状,贴生于基质表面(图 1 B)。图 1 菌株 MT01 形态特征Fig.1 Morphological characteristics of MT01 strain注:A:子实体;B:菌落2.1.2 菌株rDNA-ITS 序列分析经 PCR 扩增、与载体连接及测序,得到菌株MT01 的 ITS 序列。通过与 GenBank 已报道的序列进行比对,结果与 Coprinus 属成员具有较高的序列同源性。利用 MEGA5.0 进
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