一株贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜力评价_娄向弟.pdf
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1、研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)143DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 032996引用格式:娄向弟,张向向,贺江,等 一株贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜力评价J 食品与发酵工业,2023,49(5):143 150 LOU Xiangdi,ZHANG Xiangxiang,HE Jiang,et al Isolation and identification of a Bacillus venezensis and its pro-biotic potential evaluation J Food and Fermentation I
2、ndustries,2023,49(5):143 150一株贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜力评价娄向弟1,2,张向向2,贺江2,莫德钱1,王永慧2,熊建华1,郜彦彦1*1(江西农业大学 食品科学与工程学院,江西 南昌,330045)2(江苏沿海地区农业科学研究所,江苏 盐城,224002)摘要贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为芽孢杆菌属新型细菌。采用梯度稀释法及抑菌圈法进行菌株的分离和筛选,综合形态观察和 16S rDNA 序列比对对分离的菌株进行鉴定。通过高盐、胆盐、pH、模拟胃肠液、温度和抗生素等耐受性测定,结合体外抗氧化能力、抑菌活性以及溶血和动物饲喂试验,对
3、分离菌株进行益生潜力评价。结果显示,从农家酱中分离出一株菌 PJP10,初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。该菌对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、青枯雷尔氏菌(alstonia solanacearum)和黑曲霉(Aspergillus niger)等拮抗效果显著,可以耐受 8%NaCl、0 5%胆盐、100 水浴、pH 2 和模拟胃肠道的环境,对于头孢类、阿奇霉素等 14 种常用抗生素敏感。同时菌株 PJP10 无菌发酵液具有较好的抗氧化活性,对 A
4、BTS 阳离子和 DPPH 自由基的清除率分别为(95 66 3 1)%和(44 84 2 2)%,Fe3+还原能力和 Fe2+螯合率分别为(3019 3 7)mol/L 和(76 88 2 2)%。此外,安全性试验表明无溶血圈,彭泽鲫饲喂未见异常。综上,贝莱斯芽孢杆菌 PJP10 具有良好的益生潜力,在食品行业中具有较高的应用价值。关键词贝莱斯芽孢杆菌;益生特性;耐受性;抑菌;抗氧化活性第一作者:硕士,研究实习员(郜彦彦讲师为通信作者,E-mail:gaoyy02 hotmail com)基金项目:江西省教育厅科技项目(GJJ160414);江西省现代农业产业技术体系项目(JXAS-3)收稿
5、日期:2022-07-15,改回日期:2022-08-08贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是2005 年由UIZ-GACA 等1 发现,为革兰氏阳性好氧细菌,内生孢子,是芽孢杆菌属(Bacillus)的新种,一种新型细菌2。近年来国内外对贝莱斯芽孢杆菌的研究越来越多,主要集中在生物防治3、药物研发4、食品发酵5 和工业酶制剂6 7 等领域。贝莱斯芽孢杆菌来源非常广泛,不同生境分离得到的贝莱斯芽孢杆菌功能也不完全相同8,有研究表明贝莱斯芽孢杆菌 L-1对梨灰霉和青霉病菌有抑制作用,能引起病原菌菌丝膨大、畸形9。贝莱斯芽孢杆菌 JW-5 5 能够抑制禾旋孢腔菌(Cochli
6、oboluss ativus)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)和 梨 黑 斑 病 菌(Alternariakikuchiana Tanaka)等多种农作物病害,具有多种羊毛硫抗生素、套索肽、细菌素等抗菌肽基因簇10。而来自发酵海洋鱼酱油中的贝莱斯芽孢杆菌 SW5 对食品中多种常见病原菌具有明显的抑菌活性,发酵上清液中含有多种抑菌物质11。益生菌是一类能够在宿主体内存活并发挥有益作用的微生物,具有维持肠黏膜屏障,调节免疫功能和促进营养物质的代谢吸收等重要功能12。具有酸和胆汁的耐受性,是益生菌在小肠中生存和发挥益生作用的重要因素13。抗生素敏感、抑制肠道中的致病菌生长,
7、调节肠道菌群平衡,也是益生潜力评价的重要环节14 15。本实验室从农家酱中分离得到的一株有抑菌活性的分离株 PJP10,对其进行生理生化和16S rDNA 测序比对分析。通过耐受性测定、抗氧化活性分析和安全性试验来评价该菌株的益生潜力,为其在食品方面的开发和应用提供研究基础。1材料与方法1 1材料与设备1 1 1实验材料农家酱,市售。指示菌:肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、酿酒酵母、白色念珠菌、黑曲霉,本实验室保存;铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌,上海嘉楚生物工程有限公司;副溶血性弧菌,北纳生物技术研究院;青枯雷尔氏菌(辣椒青枯病病原菌)、黄单胞杆菌(柑橘溃疡病病原
8、菌)、刺盘孢菌(梨炭疽病病原菌),江西农业大学农学院果蔬保藏实验室。胰蛋白胨、琼脂粉、蛋白胨,生工生物工程(上食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES1442023 Vol.49 No.5(Total 473)海)股份有限公司;酵母膏、NaCl,天津市福晨化学试剂厂;DPPH、ABTS、三吡啶三吖嗪(tripyridine tria-zine,TPTZ)、过硫酸钾,美国 Sigma 公司;16 种药敏纸片,杭州滨河微生物试剂有限公司;其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯级。1 1 2培养基LB 培养基(g/L):NaCl 10 0、蛋白胨 10 0、酵母粉 5
9、 0。固体培养基另加 2%(质量分数)琼脂粉,121,灭菌 20 min 后备用。不同 pH 培养基:用稀 HCl 溶液和 NaOH 溶液将LB 培养基的 pH 调为 2 0、3 0、4 0、5 0、6 0、7 0、8.0、9 0、10 0,灭菌备用。高盐培养基:LB 培养基中 NaCl 质量分数调整为8%,灭菌备用。胆盐培养基:LB 培养基中加入胆盐,使胆盐的质量分数分别为 0 1%、0 3%、0 5%,灭菌备用。1 1 3仪器与设备FA2104 电子天平,上海菁海仪器有限公司;SW-CJ 洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Spcord
10、200 紫外可见分光光度计,德国耶拿分析仪器股份有限公司;HC-2518 高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。1 2实验方法1 2 1菌株的分离称取农家酱 5 g,加入 100 mL 灭菌水,180 r/min摇床振荡20 min,制成菌悬液,吸取1 mL 菌悬液进行梯度稀释,分别取103、104、105三个梯度均匀涂布在 LB 固体平板上,30 培养 48 h 后挑取单菌落,纯化至纯培养保存,此为分离菌。1 2 2菌种活化与培养从 80 冰箱中取出冻存的菌液,划线到 LB 固体平板,37 培养箱过夜培养,然后取培养好的单菌落转接至 50 mL LB 液体培养基中,37、180 r
11、/min摇床培养 36 h,作为种子液。无菌发酵液制备:以 2%接种量(体积分数,下同)转接种子液至 250 mL LB 液体培养基中,37、180 r/min 培养 36 h,4、10 000 r/min 离心 10 min,收集上清液,并用 0 22 m 滤膜过滤,作为无菌发酵液。1 2 3菌株的筛选和鉴定以金黄色葡萄球菌为指示菌,制备成菌悬液(1 108CFU/mL),均匀涂布到 LB 固体平板上,晾干后,加入 5 L 分离菌种子液,30 培养 1 2 d,选取能产生抑菌圈的分离菌进行革兰氏染色和 16S rDNA测序。采用 16S rDNA 测序法鉴定 PJP10 菌株,选择通用引物2
12、7F(5-GTTTGATCMTGGCTCAG-3)和1492(5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3)进行 PC 扩增,PC 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析,使用 MEGA 5 1 软件进行系统发育树构建。1 2 4PJP10 菌株的耐受性评价1 2 4 1pH 耐受性按 2%接种量将活化后的 PJP10 种子液接种到不同 pH 的 LB 液体培养基中,37,180 r/min 培养36 h 后,测定不同 pH 值培养的 OD600。1 2 4 2高盐耐受性按2%接种量转接种子液到高盐培养基,37 培养 36 h,平板菌落计数检测其盐耐受性。1 2 4 3高温
13、耐受性参考刘秀侠等16 的测定方法,略作修改。将 2瓶种子液分别于 80 和 100 水浴 10 min,以 10%的接种量转接至新鲜的 LB 液体培养基中,37 培养,测定 0 和 36 h 的 OD600,判断其耐热性。1 2 4 4胆盐耐受性以 10%的 接 种 量,将 种 子 液 分 别 接 种 至 含0.1%、0.3%、0.5%胆盐的 LB 培养基中,37 水浴4 h,平板菌落计数检测胆盐耐受性。1 2 4 5胃肠液耐受性以 10%的接种量,将种子液分别接种于人工胃液和人工肠液17 中,37 水浴 3 h,平板菌落计数分别检测胃液和肠液中 PJP10 菌株的耐受性。1 2 4 6抗生
14、素耐受性采用 K-B 纸片扩散法(Kirby-Bauer disk diffusionmethod)测定抗生素敏感性,将种子液用生理盐水梯度稀释,将菌浓度稀释到 1 108CFU/mL,再吸取50 L 稀释后的菌液均匀涂布在 LB 固体培养基上,晾干后分别将 16 种抗生素药敏纸片放入平板中,37 培养 24 h 后,观察抑菌效果并测量抑菌圈直径。1 2 5PJP10 菌株的抑菌能力测定将活化好的指示菌种子液,采用梯度稀释法用生理盐水稀释至所需的菌悬液浓度(1 108CFU/mL)。取 50 L 指示菌悬液,细菌涂布于 LB 固体平板上,研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)
15、145真菌涂布于 PDA 平板上。抑制细菌试验采用打孔法,在各孔内分别加入 100 L PJP10 无菌发酵液,以100 L 无菌 LB 液体培养基为阴性对照,37 培养24 h 后观察并测量抑菌圈直径。拮抗真菌试验在涂好指示菌的平板上滴加 5 L PJP10 种子液,以 5 L无菌 LB 液体培养基为阴性对照,30 培养 3 5 d,观察并测量抑菌圈直径。1 2 6PJP10 菌株自由基清除能力测定ABTS 阳离子自由基清除能力:参考孟歌等18 的测定方法,略作改动。用去离子水稀释 ABTS 阳离子母液,稀释至其 OD734=0 70 左右,30 避光平衡30 min,得到 ABTS 阳离子
16、工作液。吸取200 L 无菌发酵液,加入 2 0 mL ABTS 阳离子工作液,混匀后25 避光放置 20 min,于 734 nm 处测定吸光值,ABTS 阳离子自由基的清除率按公式(1)计算。ABTS 阳离子自由基清除率/%=1 A样品 A空白A()对照100(1)式中:A样品、A空白和 A对照分别是样品组、样品空白组(以去离子水替代 ABTS 溶液)和对照组(去离子水替代样品)的吸光值。DPPH 自由基清除能力:参考 TANG 等19 的测定方法,略作改动。吸取 2 0 mL 无菌发酵液加入到2.0 mL DPPH(0 2 mmol/L)溶液中,混匀后 25 避光反应 30 min,于
17、517 nm 处测定吸光值。DPPH 自由基的清除率按公式(2)计算。DPPH 自由基清除率/%=1 A样品 A空白A()对照100(2)式中:A样品、A空白和 A对照分别是样品组、样品空白组(以无水乙醇替代 DPPH 溶液)和对照组(以无水乙醇替代样品)的吸光值。1 2 7铁离子还原能力的测定参考 BENZIE 等20 的测定方法,略作改动。首先取 2 5 mL TPTZ 溶液(0 01 mol/L)和 25 0 mL 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3 6,0 3 mol/L),与 2 5 mLFeCl3(0 02 mol/L)溶液充分混匀,即得 FAP(ferricreducing antio
18、xidant power,FAP)工作液。绘制标准曲线:取 0 5 mL 浓度分别为 0.025、0.1、0.15、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、1.5 mmol/L 的FeSO4溶液与 3.0 mL FAP 工作液混合,37 保温15 min,于 593 nm 处测定吸光值。以反应体系中FeSO4浓度为纵坐标,吸光值为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程为 y=3695x+0006,2=0994 6。取 0 5 mL 无菌发酵液,加入 3 0 mL FAP 工作液,37 保温 15 min,于 593 nm 处测定吸光值。A样品 A空白 A对照的差值通过回归方程计算,获得 FeSO4的
19、浓度,即为 FAP 值。A样品、A空白和 A对照分别是样品组、样品空白组(以去离子水替代 FAP 溶液)和对照组(去离子水替代样品)的吸光值。1 2 8亚铁离子螯合能力的测定参考 DECKE 等21 的测定方法,略作改动。吸取 1 0 mL 无 菌 发 酵 液 与 1 0 mL FeSO4溶 液(2 0 mmol/L)混 合,加 入 0.2 mL 菲 咯 嗪 溶 液(50 mmol/L),充分混匀后25 保温10 min,于562 nm处测定吸光值。亚铁离子螯合率按公式(3)计算。亚铁离子螯合率/%=1 A样品 A空白A()对照100(3)式中:A样品、A空白和 A对照分别是样品组、样品空白组
20、(以去离子水替代菲咯嗪溶液)和对照组(去离子水替代样品)的吸光值。1 2 9安全性试验溶血实验:参考矫艳平等22 的测定方法,并进行修改。取 100 L PJP10 菌株的无菌发酵液采用打孔法加在血平板上,放于37 培养箱中静置24 h,观察有无溶血圈,以具有溶血性的蜡样芽胞杆菌 ATCC14579 无菌发酵液为阳性对照。饲喂实验:参考于景艳等23 的测定方法,并进行修改。试验所需的彭泽鲫(Carassius auratus varPengze)鱼苗采购自江西省南昌市水产鱼苗养殖基地,在室内驯养 1 周后,选取初始体长(8 0 5)cm,健康无病无伤 45 尾,随机分为 3 个组,每组 15
21、尾鱼,每组一个养殖容器(45 cm 32 cm 26 cm 的周转箱)开始实验,实验期间,充氧机充分曝气,每隔 1 d换一次水。每天正常投喂饲料一次,投喂饲料分别为添加1 106和 1 108CFU/g 的 PJP10 的通威鱼用膨化饲料 181 号,并以不添加 PJP10 的通威 181 号饲料为对照,喂养 21 d,观察鱼的生长状态并计算各组鱼的死亡率。1 2 10数据分析实验数据使用 Excel 2019 软件整理,使用 SPSS25 0 软件统计分析,实验结果采用平均值 标准差表示,每组设置 3 组平行,实验重复 3 次。2结果与分析2 1PJP10 菌株的分离与鉴定以金黄色葡萄球菌为
22、指示菌,筛选到一株具有明食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES1462023 Vol.49 No.5(Total 473)显拮抗活性的分离菌 PJP10(图 1-a)。分离菌 PJP10在 LB 固体平板,于37 培养箱培养 24 h 后,菌落呈浅黄色,圆形,边缘光滑,表面湿润(图 1-b)。培养48 h 进行革兰氏染色为阳性,菌体细胞成杆状,部分细菌可生成椭圆形芽孢(图 1-c)。a 抑菌圈;b 菌落形态;c 菌体形态(16 100)图 1菌株 PJP10 的形态特征Fig 1Morphological characteristics of the PJP
23、10根据测序结果可知,分离株 PJP10 的 16S rDNA序列长度为 1 496 bp,将 16S rDNA 基因序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行 BLAST 比对分 析,发 现 其 与 Bacillus velezensis GS-1、Bacillusvelezensis 504 的 16S rDNA 的基因序列最为相似,同源性达 99 67%。与 Bacillus siamensis B268、Bacillusmethylotrophicus IHB B 18137、Bacillus vallismortis Dc-02、Bacillus mojavensis HP20
24、、Bacillus amyloliquefa-ciens SF14 同源性分别为99 60%、99 53%、99 47%、99 46%和 99 40%。利用 MEGA5 1 软件的 Neigh-bor-Joining 法构建系统发育树,结果显示分离株PJP10 与 Bacillus velezensis GS-1 位于同一分支,根据序列比对分析,形态学和生理生化鉴定结果,初步确定分离株 PJP10 为 Bacillus velezensis,命名为贝莱斯芽孢杆菌 PJP10(Bacillus velezensis PJP10)(图 2)。图 2菌株 PJP10 基于 16S rDNA 序列构建
25、的系统发育树Fig 2Phylogenetic tree of the PJP10 based on16S rDNA sequence注:括号内为菌株的 16S rDNA 序列在 GenBank 中的登录号;分支结点处数字为 Bootstrap 值;标尺的数据为进化距离2 2PJP10 菌株的耐受性评价由表 1 可知,PJP10 菌株可以耐受 8%(质量分数)的高盐环境,培养 36 h 其生长浓度可以达到+(5 107CFU/mL)。胆盐对 PJP10 菌株的生长有明显的抑制作用,01%的胆盐环境 PJP10 菌株的生长浓度可达到+(108CFU/mL),在03%和05%的胆盐环境下,其生长浓
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