一株生防木霉的鉴定及环境p...基苯甲酸对其防病效果的影响_孙小涵.pdf
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1、西 北 农 业 学 报 ,():一株生防木霉的鉴定及环境 与对羟基苯甲酸对其防病效果的影响收稿日期:修回日期:基金项目:国家自然科学基金();农业高质量发展和生态保护科技创新示范项目()。第一作者:孙小涵,女,硕士研究生,研究方向为农业微生物资源与利用。:通信作者:顾欣,女,教授,硕士生导师,研究方向为农业微生物资源与利用。:孙小涵,田彦梅,顾欣,刘文辉,赵岩,杨娜(宁夏大学 农学院,银川 )摘要旨在明确西瓜枯萎病生防真菌 菌株的分类地位及环境 与对羟基苯甲酸(,)共同作用对其防病效果的影响。采用形态学和分子生物学方法分类鉴定,确定 菌株为哈茨木霉()。平板试验结果表明,对 菌株和病原菌尖镰孢
2、菌西瓜专化型的菌落生长均具有“低浓度促进、高浓度抑制”的作用,强酸和强碱环境均不利于种菌的生长;菌株和病原菌的最适生长环境 和最适 质量浓度不同,前者为和 ,后者为和 。和 共同作用下,菌株的抑菌率无显著变化。在 和 质量浓度 的土壤环境中,菌株的防病效果达到最高水平()。总之,菌株的防病效果主要受土壤 影响,其能够在 积累环境中有效发挥防病作用,具有较好的生防应用潜力。关键词哈茨木霉;拮抗作用;尖镰孢菌西瓜专化型;对羟基苯甲酸;西瓜枯萎病是西瓜的重要土传病害,病原菌是尖镰孢菌西瓜专化型(,)。发病初期,植株萎蔫;发病后期,根部腐烂,整株枯死。该病害对生产危害性大,可造成瓜田连片发病甚至绝收,
3、且病原菌在土壤存活期长,对西瓜栽种具有持续性影响。因此,有效防控枯萎病对保障西瓜生产具有重要意义。生物防控方法因对环境友好,成为当前土传病害防控的主要研究方向,高效生防菌的获得成为关键。木霉属()真菌种类丰富、分布广泛、环境适应性强,有广谱抗性,成为应用最广泛的生防真菌之一。据报道,对致病性尖镰孢菌具有生防作用的木霉有哈茨木霉()、绿色木霉(.)、长枝木霉(.)和 康 氏 木 霉(.)等,抑菌机制涉及竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导抗性作用等。其中空间和营养竞争作用是木霉菌迅速形成根际生态优势、发挥抑菌作用的重要基础。因此,分离筛选具有强竞争优势、能发挥高效生防作用的木霉菌株很有必要。西瓜
4、枯萎病在酸性和碱性土壤中均有发生,连作田中发病率更高。研究表明,和木霉的生长均受环境 的影响 。室内培养条件下,和木霉的最适生长 范围分别为 和 。土壤 过高 可 导 致 和木霉的数量减少 。因此,环境 直接影响 生 防 木 霉 的 防 控 效 果。对 羟 基 苯 甲 酸(,)是西瓜、水稻、甜瓜等多种作物根分泌物的重要组分 。西瓜连作可导致土壤中根分泌物积累,而对土壤微生物产生影响。研究表明,对 的产孢、萌发及菌丝生长均具有“低浓度促进、高浓度抑制”作用。等 从营养角度探讨土壤中添加 等有机物对木霉的影响,认为少量 有提高土壤中木霉丰度的趋势。以上研究阐述了环境 和 对 和木霉生长繁殖及拮抗效
5、果的部分影响趋势,然而 积累和 双因素叠加对木霉生防效果的影响未见报道。本研究对前期从宁夏西瓜根际土壤中分离的西瓜枯萎病生防木霉 菌株进行鉴定,明确其分类地位;采用平板试验和盆栽试验,探明不同 和 质量浓度下 和 菌株的生长情况,明确 与 共同作用下 菌株对 的抑菌率及防病效果的变化规律,为研制高效的西瓜枯萎病生防菌剂及其有效应用奠定基础。材料与方法材 料菌种:菌株和 由宁夏大学农业微生物学实验室提供,分别从宁夏西瓜健康植株根际土壤和患病植株中分离获得。其中,经回接试验验证其为西瓜枯萎病病原菌,菌株为其拮抗菌。培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(,)培养基,用于菌种活化、对峙培养和菌种保藏;马铃薯葡萄糖
6、(,)培养基,用于菌种液态发酵培养。西瓜品种:金城五号。盆栽土壤:宁夏兴仁镇西瓜田旁边的非耕作土,取土深度距地表,过 筛,备用。方 法 菌株的分类鉴定用 培养基,相对湿度 倒置培养 菌株,约,菌丝长满平板(直径,下同),转接于新的 平板,光照 黑暗倒置培养,观察菌株同心轮纹的有无、颜色及形态特征。镜检菌丝、孢子梗和孢子形态特征。鉴定依据为 和 修订的木霉种群分类系统。取活化的 菌落组织,用 法提取 。以提取的 为模板,选用 ()、延伸因子 ()、()对 菌株进行 扩增。将 产物经琼脂糖凝胶电泳并凝 胶 成 像,切 胶 回 收 片 段。纯 化 的 产物送北京六合华大基因科技有限公司测序,获得 菌
7、株 、和 基因序列。利 用 (:)中木霉属基因信息,通过 软件比对并手工矫正,构建 菌株的系统发育树,确定其分类地位。和 质量浓度对 和 菌落生长的影响采用两因素多水平试验。用过滤除菌的 和 将培养基 分别调为、,添加 使终质 量 浓 度 分别 为、,共制备 种梯度培养基。一部分用于最终 的检测,其余制备梯度平板。在梯度平板中心打个直径 的孔,放入直径相同的 或 菌碟个,倒置培养,测量菌落半径。每个处理设个重复。和 质量浓度对 菌株拮抗 的影响采用对峙培养试验。梯度平板制备方法同“”。在梯度平板上打个直径 的孔,两孔相距,各放入个 和 菌碟,培养条件同“”。测量 菌落半径,计算不同处理下 菌株
8、对 的抑菌率。以不放 菌碟为对照。每个处理设个重复。抑菌率计算公式如下:抑菌率(对照 菌株半径对峙培养 菌株半径)对照 菌株半径 土壤 和 质量浓度对 拮抗 的影响采用盆栽试验。将 和 菌株分别接种于 培养基,培养。血球计数板法检测孢子数量。用无菌水制备 孢子悬液,浓度为 ,孢子悬液浓度为 、和。土壤经 、灭菌制成无菌土。用无菌 和 调节土壤 分别为、,随后添加 使土壤中 质量浓度分别为、,混合均匀。孢子悬液和无菌土以(质量比)混匀制成病菌土。孢子悬液和无菌土以(质量比)混匀制成 接种土。每个营养钵(口径 ,底径,高 )装 接种土 ,均匀拌入病菌土。每钵定植健康、片真叶的西瓜幼苗株。每浇次 营
9、养液倍稀释液,每次每钵 。根据土壤湿度,每钵浇无菌水 。保持充足光照,温度约。每处理 株,培养,记录瓜苗发病等级,计算发病率、病情指数和防治效果。瓜苗发病等级标准:级为茎内维管束内外无症状;级为茎内维管束变色部分;级为茎内维管束变色部分 ;级为茎内西北农业学报 卷维管束变色部分 ;级为茎内维管束变色部分,部分叶片萎蔫;级为整株萎蔫枯死。发病率、病情指数和防治效果计算公式如下:发病率发病株数调查总株数 病情指数(病级株数代表数值)(调查发病总株数最高级值)防治效果(对照发病率处理发病率)对照发病率 处理与统计分析采用 软件处理数据并制作图表。采用 统计软件进行方差分析和相关性分析,在 水平上进行
10、差异显著性检验。结果与分析 菌株的形态学鉴定菌株生长迅速,初为白色,卷毛状菌丝。随着培养时间增加,产孢簇逐渐变为绿色,老熟时呈暗绿色;分生孢子梗瓶状,较细且稍有弯曲,分枝呈轮状排列,大多轮,较短且无分枝(图,)。分生孢子浅绿色,壁光滑,椭球形,()()(图)。培养,菌落出现墨绿色与白色相间的同心轮纹(图),背面无色(图)。培养的菌落呈墨绿色,表面毡毯状,上有少量白色菌丝(图)。依据形态特征,初步鉴 定 菌 株为哈 茨木霉(.)。、分生孢子梗;分生孢子;菌落正面(培养);菌落背面(培养);菌落正面(培养);标尺为,;();();();图 菌株的形态与培养特征 菌株的分子生物学鉴定将 菌株 (登录
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