DB44_T 2220-2019柑橘黄龙病菌数字PCR检测.pdf
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1、ICS 65.020.99 B 16 DB44 广东省地方标准 DB44/T 22202019 柑橘黄龙病菌数字 PCR 检测 Digital PCR for the molecular detection of Citrus Huanglongbing 2019-12-26 发布 2020-03-26 实施 广东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由广东省农业厅提出并归口。本标准起草单位:广东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人:程保平、彭埃天、宋晓兵、崔一平、凌金锋、陈霞。柑橘黄龙病菌数字 PCR 检测 1 范围 本标准规定了
2、柑橘黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)数字PCR检测的样品采集制备、检测操作方法及结果判定标准。本标准适用于柑橘出圃苗木和接穗等繁殖材料的检验、田间柑橘黄龙病染病植株的快速检测以及虫媒亚洲柑橘木虱Diaphorina citri内柑橘黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌的检测鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 5040 柑橘苗木产地检疫规程 GB/T 9659 柑橘嫁接苗分级及检验 GB/T 194
3、95.2 转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 28062 柑橘黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 柑橘黄龙病的症状 symptoms of Citrus Huanglongbing 该病的典型发病症状为:病株叶片斑驳黄化或均一黄化、嫩梢或枝梢黄化、果实畸形味涩,严重时引起植株死亡。3.2 柑橘黄龙病菌 pathogen of Citrus Huanglongbing 柑橘黄龙病的病原是一种韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)的革兰氏阴性细菌,已发现有亚洲韧皮部杆菌Candidatus Liberibacter asi
4、aticus、非洲韧皮部杆菌Candidatus Liberibacter africanus和美洲韧皮部杆菌Candidatus Liberibacter americanus 3个种。目前在我国传播的主要是亚洲韧皮部杆菌。本标准规定了亚洲韧皮部杆菌的检测方法,对非洲和美洲韧皮部杆菌的检测方法可参见附录A。3.3 柑橘红鼻子果 colour infected fruit 柑橘黄龙病病树上不能正常转色的病果。常在果蒂部转红色,果脐部仍为绿色。果实畸形变小、味涩、质硬,常有发育不全的种子。3.4 亚洲韧皮部杆菌重组质粒 recombinant plasmid of Candidatus Libe
5、ribacter asiaticus 以亚洲韧皮部杆菌的16S rDNA为靶标,利用特异引物OI1/OI2c(Jagoueix el al.,1994)扩增获得的亚洲韧皮部杆菌特异DNA扩增产物,经构建重组质粒、转入大肠杆菌DH5菌株中繁殖扩增后,重新提取获得的重组质粒DNA作为亚洲韧皮部杆菌数字PCR检测的阳性对照。4 实验室设置 参照GB/T 19495.2设置实验室。5 主要仪器设备和主要试剂 参照GB/T 19495.2。6 取样及样品处理 6.1 取样用具处理 取样工具应经过121、20 min高压蒸汽灭菌。田间采集每个样品后,取样工具应做消毒处理,以避免样品间交叉污染。6.2 取样
6、方法 6.2.1 成年树样品取样法 疑似病树直接取枝条中下部有病症的成熟叶片20片;如果树体没有疑似症状,则按照树冠东南西北四个方位采集样品,每个方位随机采集枝条中下部成熟叶片各5片,每棵树采集叶片20片。疑似病果/红鼻子果从四个方位各取直径为1 cm的圆形果皮,每个病果采集4块果皮;无症状的果实以相同的方法采集果皮。6.2.2 种苗取样法 根据GB 5040,按照柑橘种苗出圃的抽检方法和数量进行取样。6.2.3 传病媒介亚洲柑橘木虱采样方法 传病媒介亚洲柑橘木虱采样参照GB/T 28062和GB/T 9659进行。6.3 样品的存储与处理 6.3.1 样品信息的记录 详细记录样品采集信息(见
7、附录B)。6.3.2 样品的保存 采集到的样品保存于4条件,于2 d内寄送有资质的实验室检测。样品在实验室中可置于4保存7 d,标准样品和需要长期保存的特殊样品应置于-80保存1 y。6.3.3 废弃样品的处理 废弃的样品应经过121、15 min高压蒸汽灭菌,达到无害化处理。6.3.4 样品 DNA 的制备 样品DNA制备应该在检测实验室的样品制备区进行。样品DNA提取可使用商业化DNA提取试剂盒或自行配制的CTAB灭菌溶液。具体步骤参照GB/T 19495.2进行。6.3.5 样品 DNA 的保存 制备好的DNA样品在4保存1 d10 d。需要长期保存的DNA样品应置于-80保存1 y2
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