不同光色条件下京海黄鸡垂体转录组功能分析_王莹.pdf
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1、3期797不同光色条件下京海黄鸡垂体转录组功能分析王莹,李扶石,张杨扬,王金玉*(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009)摘要:【目的】对不同光色条件下京海黄鸡垂体进行转录组测序分析,了解不同光色条件下京海黄鸡垂体的表达谱,旨在筛选出红光影响京海黄鸡生殖激素合成的关键基因,为提高种鸡产蛋性能提供理论基础。【方法】红光组京海黄鸡产蛋量(90.61枚)显著高于白光组(87.44枚)(P0.05)。选取红光和白光条件下京海黄鸡各3只,采集其垂体进行高通量测序,利用HISAT和DESeq等方法获得差异表达基因(DEGs)进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。【结果】通过高通量测序获得4
2、8927948844980565639条Raw reads,比对到参考基因组的read比对率在92.00%以上,GC含量为48.54%49.11%。将红光和白光条件下京海黄鸡的垂体进行比较,共获得155个DEGs,其中红光组与白光组(RP vs WP)相比,有90个基因表达上调和65个基因表达下调。对DEGs进行GO功能注释分析,主要在生物调控、细胞过程、细胞、细胞组分、连接和催化活性功能等重要生物途径。KEGG信号通路分析结果显示,DEGs主要富集在细胞因子细胞因子受体相互作用、类固醇激素的生物合成通路、视黄醇的新陈代谢、花生四烯酸代谢、神经活性配体受体相互作用等信号通路,这些通路中的促性腺
3、激素释放激素基因(GNRH1)、分泌型磷蛋白1基因(SPP1)、信号转导蛋白1基因(SMAD1)、骨形态形成蛋白拮抗蛋白2抗体基因(GREM2)和表皮调节素基因(EREG)等表达可能受光色的影响,从而影响种鸡的产蛋性能。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果证明了转录组测序结果准确可靠。【结论】与白光相比,红光能显著提高京海黄鸡的产蛋量。筛选获得的GNRH1、SPP1、SMAD1、GREM2和EREG等基因可能在光色调控京海黄鸡产蛋性能中发挥重要作用,可作为种鸡垂体组织调控其产蛋性能分子机制研究的关键基因。关键词:光色;京海黄鸡;转录组;垂体中图分类号:S831.4文献标志码:A文章编号:2
4、095-1191(2023)03-0797-09收稿日期:2022-11-03基金项目:国家青年科学基金项目(31702155);江苏高校优势学科建设工程四期项目(2022)通讯作者:王金玉(1952-),https:/orcid.org/0000-0002-5706-0624,教授,主要从事家禽遗传育种与繁殖研究工作,E-mail:第一作者:王莹(1989-),https:/orcid.org/0000-0002-8515-5559,博士,副教授,主要从事家禽繁殖研究工作,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(3):797-8
5、05ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.015Transcriptome analysis of pituitary gland of Jinghai YellowChicken under different light color conditionsWANG Ying,LI Fu-shi,ZHANG Yang-yang,WANG Jin-yu*(Department ofAnimal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou
6、,Jiangsu 225009,China)Abstract:【Objective】The objective of this study was to analyze the transcriptome sequencing of pituitary glands ofJinghai Yellow Chickens under different light color conditions,to understand the expression profile of the pituitary glandsof Jinghai Yellow Chickens under differen
7、t light color conditions,to screen out the key genes of red light affecting the syn-thesis of reproductive hormones in Jinghai Yellow Chickens,so as to provide theoretical basis for improving the layingperformance of breeding chickens.【Method】The egg production of Jinghai Yellow Chickens in the red
8、light group(90.61eggs)was significantly higher than that of the white light group(87.44 eggs)(P2且Q0.05筛选差异表达基因(DEGs)。利用GO数据库对DEGs进行功能注释,利用KEGG数据库对DEGs进行信号通路富集分析。利用STRING数据库和Cy-toscape软件构建DEGs的可视化蛋白-蛋白互作(PPI)网络,利用MCODE插件获取PPI网络的核心网络,并进一步使用ClueGO插件分析每个核心网络中基因的生物功能。1.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测为了验证转录组测序结果的可靠
9、性,随机选择促性腺激素释放激素基因(GNRH1)、分泌型磷蛋白1基因(SPP1)、信号转导蛋白1基因(SMAD1)、骨形态形成蛋白拮抗蛋白2抗体基因(GREM2)、表皮调节素(EREG)、细胞色素P450家族成员1B1基因(CYP1B1)、昼夜节律蛋白3基因(PER3)和多功能表皮生长因子6基因(MEGF6)等8个DEGs进行qRT-PCR检测,以-actin为内参基因。利用PrimerPremier5设计引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。利用TRIzol提取总RNA,再利用Fast Quant RT试剂盒进行反转录合成cDNA第一链。利用SuperReal PreMi
10、x Plus(SYBR Green)试剂盒进行qRT-PCR检测,反应体系20.0 L:2Su-per Real Premix 10.0 L,50ROX Reference Dye0.4 L,10 mol/L上、下游引物各0.6 L,200 ng/LcDNA 1.0 L,ddH2O 补足至20.0 L。扩增程序:95 预变性15 min;95 变性 10 s,60 退火/延伸32 s,进行40个循环;10 保存。采用2-Ct法计算基因的相对表达量。1.6统计分析利用SPSS 13.0对试验数据进行单因素方差分析。2结果与分析2.1不同光色对京海黄鸡产蛋量的影响红光组和白光组300日龄京海黄鸡的
11、产蛋量如基因 GeneSMAD1SPP1GNRH1EREGCYP1B1PER3MEGF6GREM2-actin引物序列 Primer sequenceF:5-TGGAAACAATTGAGCCTTGC-3R:5-CCCCAAATCCAACAGTTGG-3F:5-CAAAGCTGCCAGGAAGCTCAT-3R:5-TCCACCTCAGGGCTGTCAAA-3F:5-CATCTGTGGCAATCTGCTTGG-3R:5-ATCAGGCTTGCCATGGTTTCC-3F:5-GGGACGGTGCGGCTG-3R:5-CGAGGAAGAGCAGTAGGCTG-3F:5-CATCTTCCTCATCAGG
12、TATCCAAAAGT-3R:5-GTACAGGAAAGCCACGATGTAG-3F:5-CACAGGTTCAGCAGCATCAG-3R:5-ATCATCACCCAGGCTGACTC-3F:5-CTGCGAGTTAGGCACAATGC-3R:5-CTCCTCGCAGCCTTCCTG-3F:5-GCAGCGCGTGCGATGAT-3R:5-TGATGATGGTGCGGCTTACG-3F:5-CAGACATCAGGGTGTGATGG-3R:5-TCAGGGGCTACTCTCAGCTC-3目的片段长度(bp)Product length11617187143130225228292183表 1qRT
13、-PCR引物序列信息Table 1Primer sequence information for qRT-PCR王莹等:不同光色条件下京海黄鸡垂体转录组功能分析54卷南 方 农 业 学 报 800图1所示。红光组京海黄鸡产蛋量(90.61枚)显著高于白光组(87.44枚)(P0.05),说明红光能提高京海黄鸡的产蛋性能。2.2转录组测序分析结果对6个样本的cDNA文库进行转录组测序,结果共获得48927948844980565639条Raw reads,比对到参考基因组的reads比对率在92.00%以上,比对到参考基因组唯一位置的reads比对率在90.00%以上(表2)。将原始数据经过质量
14、控制和过滤后,获得Clean reads为4674658047397238条,有效碱基百分比在91.20%以上,Q30在92.40%以上,GC含量为48.54%49.11%(表3),说明测序数据可信度高,可用于后续生物信息学分析。2.3DEGs表达分析对6个样本进行转录组测序,将获得的种鸡垂体基因进行FPKM表达量分析,并利用DESeq筛选出DEGs,结果共获得155个DEGs,其中红光组与白光组(RP vs WP)相比有90个DEGs显著上调表达,65个DEGs显著下调表达(图2),其中,显著差异表达排列前20的基因如表4所示。2.4GO功能注释分析结果对155个DEGs进行GO功能注释分析
15、,结果发现其分为三大类,共50个条目(图3),其中生物过程23个条目,细胞组分17个条目,分子功能10个条目,主要注释为生物调控(Biological regulation)、细胞过程(Cell process)、细胞(Cell)、细胞组分(Cell compo-nent)、连接(Binding)和催化活性功能(Catalytic ac-tivity)等功能。2.5KEGG信号通路富集分析结果由图4可知,155个DEGs富集到42条KEGG信号通路上,主要在细胞因子细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、类固醇激素的生物合成通路(S
16、teroid hormone biosynthesispathway)、视黄醇的新陈代谢(Retinol metabolism)、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、神经活性配体受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)等信号通路上。2.6蛋白-蛋白互作网络构建及筛选红光组和白光组垂体组织的DEGs主要聚集在蛋白-蛋白互作网络14个模块,包括117个基因,共样本SampleRP1RP2RP3WP1WP2WP3Raw reads(条)4912192169494623836548927948844980565
17、63949805656394940324707比对到参考基因组的reads比对率(%)Proportion of mapped readsto the reference genome93.5792.1293.3393.4493.8293.47比对到参考基因组唯一位置的reads比对率(%)Proportion of unique mappedreads to the reference genome92.0190.3991.7291.8392.4491.71比对到基因组正链比对率(%)Proportion of mappedreads to+chain45.9645.1945.8545.89
18、46.1945.81比对到基因组负链比对率(%)Proportion of mappedreads to-chain45.9845.2245.8845.9246.2345.84样本SampleRP1RP2RP3WP1WP2WP3Clean reads(条)468964364717472046754790473972384674658046870504有效碱基(Gb)Clean base6.766.776.756.836.746.76有效碱基百分比(%)Clean base proportion91.7591.3091.9091.3891.3791.26Q30(%)92.7492.7392.77
19、92.6892.9692.46GC含量(%)GC content48.9449.0748.6949.1148.5448.909590858075ab产蛋量(枚)Egg production(egg)红光白光图 1不同光色条件下京海黄鸡产蛋量比较Fig.1Comparison of egg production of Jinghai Yellow Chi-ckens under different light color conditions不同小写字母表示差异显著(P0.05)Different lowercase letters represented significant differe
20、nce(P0.05)表 2测序数据与参考基因组对比情况Table 2Comparison of sequencing data with the reference genome表 3转录组数据质量分析Table 3Quality analysis of transcriptome data光色 Light color3期801500个互作关系(图5)。网络中节点度较高的节点基因包括SMAD1、SPP1、成对盒基因(PAX5)、成骨细胞特异性因子2基因(POSTN)和肌球蛋白基因(MYO1G),其中SMAD1和SPP1存在互作关系,两者在生殖激素合成中发挥重要作用,可作为候选关键基因。2.7D
21、EGs表达分析为了进一步验证转录组测序的可靠性,利用qRT-PCR选择8个DEGs进行验证,结果(图6)发现,SMAD1、SPP1、GNRH1、EREG、CYP1B1、PER3、MEGF6和GREM2基因的表达情况与转录组测序结果基本一致,证明本研究转录组测序结果可靠。由图6还可知,GNRH1、EREG和SPP1基因的表达水平较高,红光诱导SMAD1、SPP1、GNRH1、EREG和CYP1B1基因表达上调,但抑制MEGF6、GREM2和PER3基因的表达。3讨论光波长影响家禽行为、生长和繁殖,红光能显著提高京海黄鸡的产蛋性能。本研究对红光和白光条件下京海黄鸡垂体组织进行转录组测序,共获得15
22、5个DEGs。在这些DEGs中,包括GNRH1和SPP1等上调基因与生殖激素的合成密切相关。GNRH1是GNRH在垂体中的主要形式,可刺激垂体前叶FSH和LH的合成和分泌,在家禽卵泡发育和性成熟过程中起重要作用(Okubo and Nagahama,2008;Chen et al.,2019)。Li等(2022)研究发现,GNRH1基因的表达水平与蛋鸡的产蛋率高度正相关。Bhat-tacharya等(2019)也研究发现,GNRH1基因具有多态性,对白来航鸡的体重、产蛋量和蛋品质性状有显著影响。GNRH1对小鼠垂体细胞FSHb基因的表达的影响是由孕酮受体(PGR)磷酸化、FSHb启动子内的PG
23、R响应元件以及NCOA3基因共同介导(An et al.,2009)。本研究发现,红光能提高京海黄鸡垂体GNRH1基因的表达水平和提高产蛋量,与Reddy等(2012)的研究结果一致,即白来航鸡饲养在红光条件下,刺激GNRH1的分泌来降低F1卵泡对LH的响应,从而增加其产蛋量。SPP1是一种细胞外基质蛋白和整合素配体(Fisher et al.,2001),SPP1基因在垂图 2DEGs的火山图及表达情况Fig.2Volcano map and expression of DEGs表 4京海黄鸡垂体显著差异表达排名前20的基因Table 4 Top 20 significantly DEGs
24、in the pituitary gland ofJinghai Yellow Chickens基因GeneGNRH1LOC107049998THEMIS2LOC107049500MYH1BIRX4RP11LOC425214LOC107050349MYH1ANMULOC112531323GATMLOC107054696GRXCR1LOC112532872MYH7S100A14CENPIPDCL2log2FoldChange9.477.064.704.083.963.823.813.733.503.27-6.41-5.08-4.36-4.07-4.02-3.33-3.27-2.88-2.73-2
25、.72P4.6210-23.7410-24.2210-23.5310-42.1210-21.3610-21.9810-31.1310-62.4010-186.2910-51.2110-67.0510-32.4510-31.9910-255.2510-45.710-51.3810-23.70210-23.53710-22.3210-2表达变化Change of expression上调上调上调上调上调上调上调上调上调上调下调下调下调下调下调下调下调下调下调下调ABDEGs数量DEGs number75502509065RP vs WP-6-4-20242520151050log2Fold Cha
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