shRNA SIRT3基因对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及机制研究.pdf
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1、收稿日期 2020-02-25摇 修回日期 2022-06-11基金项目 河南省科技发展计划基金项目(142102310459)作者单位 1.陕西省榆林市第一医院 检验科,719000;2.陕西省榆林市医药卫生健康发展研究中心,719000;3 陕西省榆林市第二医院 检验科,719000作者简介 王晓亮(1983-),女,主任检验师.文章编号 1000鄄2200(2023)05鄄0629鄄04检验医学shRNA SIRT3 基因对乳腺癌细胞MCF鄄7 侵袭能力的影响及机制研究王晓亮1,郑摇 伟2,赵摇 娜3摘要目的:探讨 shRNA SIRT3 基因对乳腺癌细胞 MCF鄄7 侵袭能力的影响及机
2、制。方法:以人乳腺癌细胞系 MCF鄄7 细胞为实验对象。按照处理方法将乳腺癌 MCF鄄7 细胞分成 3 组,即空白对照组(不转染慢病毒的乳腺癌 MCF鄄7 细胞组)、阴性对照组(乳腺癌 MCF鄄7 细胞转染无序序列慢病毒载体)和 shRNA 干扰组(乳腺癌 MCF鄄7 细胞转染 shRNA SIRT3 序列慢病毒载体)。采用实时荧光定量 PCR 和 Western blotting 等方法检测 SIRT3 和凋亡相关因子 caspase鄄3、caspase鄄9 的表达水平;采用Transwell 试剂盒检测细胞的侵袭能力。结果:shRNA 干扰组 SIRT3 mRNA 相对表达量均明显低于阴性
3、对照组和空白对照组(P 0.01),caspase鄄3 mRNA、caspase鄄9 mRNA 相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)。Western鄄blotting检测结果显示,shRNA 干扰组 SIRT3 蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)。Transwell 实验结果显示,shRNA 干扰组迁移细胞数均明显少于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)。结论:shRNA鄄SIRT3 的慢病毒干扰载体可促进人乳腺癌细胞的凋亡,抑制人乳腺癌细胞的侵袭。关键词
4、 乳腺肿瘤;沉默信息调节因子;断链 RNA 干扰;慢病毒转染中图法分类号 R 737.9 摇 摇 摇 文献标志码 A摇 摇 摇 DOI:10.13898/ki.issn.1000鄄2200.2023.05.018Effect of shRNA SIRT3 gene on invasive abilityof breast cancer cell MCF鄄7 and its mechanismWANG Xiao鄄liang1,ZHENG Wei2,ZHAO Na3(1.Department of Laboratory Medicine,The First Hospital of Yulin Ci
5、ty,Yulin Shanxi 719000;2.Medical and Health DevelopmentResearch Center,Yulin Shanxi 719000;3.Department of Laboratory Medicine,The Second Hospitalof Yulin City,Yulin Shanxi 719000,China)Abstract Objective:To explore the effect of shRNA SIRT3 gene on invasive ability of breast cancer cell MCF鄄7 and i
6、ts mechanism.Methods:Human breast cancer cell line MCF鄄7 cells were used as experimental subjects.According to the treatment method,breastcancer MCF鄄7 cells were divided into three groups:blank control group(breast cancer MCF鄄7 cells without lentivirus transfection),negative control group(breast can
7、cer MCF鄄7 cells transfected with disordered sequence lentivirus vector)and shRNA interference group(breast cancer MCF鄄7 cells transfected with shRNA SIRT3 sequence lentivirus vector).The expression levels of SIRT3 and apoptosis鄄related factors caspase鄄3 and caspase鄄9 were detected by RT鄄PCR and West
8、ern blotting,and the invasive ability of cells was detected byTranswell kit.Results:The relative expression of SIRT3 mRNA in the shRNA interference group was lower than that in the negativecontrol group and the blank control group,and the relative expression of caspase鄄3 mRNA and caspase鄄9 mRNA was
9、higher than thosein the negative control group and the blank control group(P 0.01).The protein expression levels of SIRT3,caspase鄄3 and caspase鄄9detected by Western blotting showed the same trend.The results of the Transwell experiment showed that the number of migrated cells inthe shRNA interferenc
10、e group was less than that in the negative control group and the blank control group(P 12 h)。SIRT鄄3 一抗经一抗稀释液 1颐 10 000 稀释后加入样本离子膜。第 2 天用 PBST 稀释液洗膜,重复 3 次,加用山羊抗小鼠 IgG 二抗经二抗稀释液 1颐 1 000 稀释后孵育二抗1.5 h,用 PBST 稀释液洗膜,重复 3 次,而后用DAB 显影液处理样本。Image J 软件分析蛋白条带。1.7摇 Transwell 小室实验检测细胞的迁移摇 3 组细胞经胰蛋白酶消化后收集,按说明书要求
11、,将基底膜的基质原液放在冷藏冰箱(4 益)过夜融化,然后与预冷的无血清的 DMEM 培养基按照 1颐 3 比例配置侵袭 上 室 凝 胶 液 体,以 每 孔 55 滋L 的 量 包 被Transwell 小室的上室,放置37 益孵育箱,2 h 后使上室成胶。然后上室每孔接种 200 滋L 不含血清的细胞培养液,下室加入 10%胎牛血清的 DMEM 培养液500 滋L。将 Transwell 板放置在 37 益孵育箱中培养24 h 后用结晶紫染色。然后将 Transwell 板用倒置036J Bengbu Med Coll,May 2023,Vol.48,No.5光学显微镜,拍照,并进行细胞计数。
12、所有实验均重复 3 次。1.8摇 统计学方法摇 采用方差分析和 q 检验。2摇 结果2.1摇 免疫组织化学染色摇乳腺癌组织和癌周组织的 SIRT3 免疫组织化学染色结果显示,肿瘤组织的SIRT3 棕色染色明显强于癌旁组织。2.2摇 3 组 SIRT3 mRNA、caspase鄄3 mRNA 和 caspase鄄9 mRNA 表达比较摇 shRNA 干扰组 SIRT3 mRNA 相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase鄄3 mRNA、caspase鄄9 mRNA 相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)(见表 2)。摇 表2摇 3 组 SIRT3 mRNA、c
13、aspase鄄3 mRNA、caspase鄄9 mRNA相对表达量比较(n=3;x 依 s)分组SIRT3 mRNAcaspase鄄3 mRNA caspase鄄9 mRNA空白对照组1.00 依0.01*1.00 依0.02*1.00 依0.02*阴性对照组1.08 依0.01*1.11 依0.03*0.53 依0.03*shRNA 干扰组 0.42 依0.013.17 依0.118.29 依0.10F3 892.001 003.5015 077.34P0.010.010.01MS组内0.0010.0050.004摇 摇 q 检验:与 shRNA 干扰组比较*P 0.012.3摇 3 组 S
14、IRT3、caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量比较摇Western鄄blotting 检测结果显示,shRNA 干扰组 SIRT3 蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)(见表 3)。摇 表 3摇 3 组 SIRT3、caspase鄄3、caspase鄄9 蛋白相对表达量比较(n=3;x 依 s)分组SIRT3 蛋白caspase鄄3 蛋白caspase鄄9 蛋白空白对照组1.00 依0.01*1.00 依0.01*1.00 依0.39*阴性对照组3.50 依0.3
15、5*2.00 依0.34*3.00 依0.43*shRNA 干扰组 0.50 依0.325.00 依0.248.00 依0.32F103.33225.04266.27P0.010.010.01MS组内0.0750.0580.147摇 摇 q 检验:与 shRNA 干扰组比较*P 0.012.4摇 Transwell 实验检测细胞迁移摇shRNA 干扰组迁移细胞数均明显少于阴性对照组和空白对照组(P 0.01)(见表 4)。3摇 讨论摇 摇 恶性肿瘤是威胁人类生存的重大公共卫生问题之一,寻求恶性肿瘤的治疗靶点具有十分重要的研究意义8-9。SIRT3 基因与恶性肿瘤的侵袭性密切相关10-11。本研
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