ICG-001对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制.pdf
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1、1 8 7CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 5 月第 35 卷第 3 期收稿日期:2023-03-09;修订日期:2023-04-21基金项目:国家自然科学基金(81872279)作者信息:史建红,E-mail:jianhong_SJH。*通信作者,张 钰,ICG-001对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制史建红,陈丁雄,卢晓童,郝佳洁,蔡岩,王明荣,张钰*(国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院,分子肿瘤学国家重点实验室,北京100021)Inhibitory effect
2、of ICG-001 onproliferation of esophagealsquamous carcinoma cells andits molecular mechanismsSHI Jianhong,CHEN Dingxiong,LU Xiaotong,HAO Jiajie,CAI Yan,WANG Mingrong,ZHANG Yu*(State Key Laboratory of Molecular Oncology,National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospita
3、l,Chinese Academy of Medical Sciences and PekingUnion Medical College,Beijing 100021,China)【摘要】目的:检测小分子抑制剂ICG-001对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用并探讨其分子机制。方法:使用50和100 mol/L的小分子抑制剂ICG-001处理食管鳞癌细胞系KYSE410和KYSE450,以溶剂DMSO处理细胞作为对照,进行细胞增殖活力、集落形成能力、细胞周期分布及凋亡检测;分别使用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测ICG-001处理细胞中相关分子(SKP2、Survivin
4、和TCF4)mRNA和蛋白水平的表达变化。结果:与对照组比较,ICG-001处理可显著抑制食管鳞癌细胞系KYSE410和KYSE450的增殖活力和集落形成能力,并可显著诱导细胞发生G0/G1期阻滞(P0.01);SKP2、Survivin和TCF4的mRNA和蛋白表达水平在ICG-001处理组均显著降低(P0.01)。结论:ICG-001可显著抑制食管鳞癌细胞的增殖活力和集落形成能力,并可诱导细胞发生G0/G1期阻滞,该作用可能与其抑制-catenin/TCF4的转录活性及其下游分子Survivin和SKP2的表达有关。【关键词】ICG-001;食管鳞癌;增殖能力;细胞周期;小分子抑制剂中图分
5、类号:R735.1文献标志码:A文章编号:1004-616X(2023)03-0187-06doi:10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.005【ABSTRACT】OBJECTIVE:ToinvestigateeffectsofsmallmoleculeinhibitorICG-001onmalignantphenotypesofesophagealsquamouscarcinoma(ESCC)cellsandtoexploreitsmolecularmechanisms.METHODS:The ESCC cell lines KYSE410 and KYSE450
6、 were treated with ICG-001 of 50 and 100 mol/L,or with solvent DMSO as control.Treated cells were evaluated for cell proliferation viability,colony formationability,cellcycledistributionandapoptosis.mRNAandproteinexpressionofrelatedmolecules(SKP2,Survivin,and TCF4)were detected by real-time PCR(qPCR
7、)and Western blot.RESULTS:Compared withthe control group,ICG-001 treatment significantly inhibited the proliferation and colony formation ability ofKYSE410 and KYSE450,and significantly induced G0/G1 phase arrest(P0.01).In addition,expression levelsof SKP2、Survivin and TCF4 were significantly decrea
8、sed(P0.01).CONCLUSION:ICG-001 significantlyinhibited the proliferation viability and colony formation ability,and induced G0/G1 phase arrest of the twoESCC cell lines.The mechanisms may be related to the inhibition of b-catenin/TCF4 transcriptional activityand the expression of downstream molecules:
9、Survivin and SKP2.【KEY WORDS】ICG-001;esophageal squamous cell carcinoma;proliferation;cell cycle;small moleculeinhibitor食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤,我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家。统计数据显示,2016年食管癌的发病数和死亡数分别位居我国恶性肿瘤的第 6 位和第 4 位1。食管鳞癌(esophagealsquamous cell carcinoma,ESCC)是我国食管癌的主要病理类型,其预后差,死亡率高,多年来中晚期患者术后的5年生存率一直徘徊在15%25%
10、2。目前临床上尚缺乏可高效治疗ESCC的药物,因此迫切需要寻论著癌变畸变突变1 8 8CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023找新的有效药物。Wnt/-catenin 信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移、上皮-间质转化和肿瘤干细胞的自我更新等过程中发挥重要作用3。既往研究表明,Wnt/-catenin信号通路的异常激活与ESCC、肝癌和结直肠癌等实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关4-7,提示Wnt/-catenin信号通路是相关恶性肿瘤治疗的潜在靶点。ICG-001 是 Wnt/-cateni
11、n信号通路的一种小分子抑制剂,主要通过竞争性结合CREB结合蛋白(creb-binding protein,CBP)从而干扰 CBP 与-catenin 的相互作用,由此抑制-catenin/TCF对下游靶分子的转录活化8。目前,已有多项研究证实ICG-001可显著抑制结直肠癌、胰腺导管腺癌、唾液腺肿瘤和急性淋巴细胞白血病等多种恶性肿瘤细胞在体内、外的增殖能力8-11。然而,ICG-001在ESCC中的作用目前尚无文献报道。因此,本研究检测分析了 ICG-001 对 ESCC 两种细胞系KYSE410和KYSE450细胞增殖能力、细胞凋亡及周期分布的影响,并通过检测相关分子的mRNA和蛋白表达
12、水平的变化探讨其作用的分子机制。1材料与方法1.1试剂和仪器细胞培养基RPMI-1640为Cell Technology公司产品。胎牛血清购自Newzerum公司,SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自美仑生物公司。Opti-MEM培养基购自Gibco公司。Lipofectamine 2000转染试剂、BCA蛋白定量试剂盒、ECL 化学发光检测试剂购自 ThermoFisher Scientific 公司。CCK-8细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒均购自日本同仁化学公司。细胞RNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物公司。TB GreenPremix Ex TaqTM试剂盒购自日
13、本TaKaRa公司。HiFiScript cDNA合成试剂盒购自北京康为世纪公司。SKP2、Survivin和TCF4抗体购自CST公司,GAPDH抗体购自Proteintech公司。DMSO购自 Sigma 公司。抑制剂 ICG-001 购自 Selleck 公司。电 泳 仪 和 实 时 荧 光 定 量 PCR(quantitative real-timePCR,qPCR)仪购自Applied Biosystems公司。湿转转膜仪购自Tanon公司。酶标仪购自Bio Tek Instrument公司。化学发光成像仪购自Beckman公司。1.2实验方法1.2.1细 胞 培 养食 管 鳞 癌
14、细 胞 系 KYSE410 和KYSE450购自南京科佰生物公司,均使用添加10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 0.1 mg/mL 链霉素的RPMI-1640培养基,置于CO2体积分数为5%的恒温培养箱中37 进行培养。1.2.2细胞增殖实验在96孔板中每孔接种3 000个对数生长期的细胞,每组设3个平行复孔。待细胞完全贴壁后,分别用25、50和100 mol/L的ICG-001处理细胞24和48 h后使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力,获得D(450)值,以 DMSO 处理细胞作为对照组,并按以下公式计算细胞增殖率。细胞增殖率/%=D(450)实验组-D(450)空白对照组/D(4
15、50)阴性对照组-D(450)空白对照组100%1.2.3平板集落形成实验在 6 孔板中每孔接种1 000个对数生长期的细胞,并分别用50和100 mol/L的ICG-001处理KYSE410和KYSE450细胞进行平板集落形成实验。每组设3个平行复孔。当出现肉眼可见的克隆时,终止培养,甲醇固定后用0.5%结晶紫染液染色并计数。1.2.4细胞周期检测分别使用50和100 mol/L抑制剂ICG-001处理KYSE410和KYSE450细胞24 h后收集细胞沉淀,用70%乙醇固定过夜,用含RNA酶的PI染色,使用流式细胞仪进行检测,并用Modifit软件进行数据分析,以DMSO处理细胞作为对照组
16、。1.2.5细胞凋亡检测细胞分组同1.2.4。使用抑制剂ICG-001处理48 h后收集细胞,按照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。使用流式细胞仪进行检测,用Flowjo.10软件作图。1.2.6qPCR检测细胞分组同1.2.4。ICG-001处理24 h 后收集细胞,使用 RNA 提取试剂盒提取总RNA,使用 HiFiScript cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。使用TB GreenPremix Ex TaqTM试剂盒及ABI Quant-Studio 5 PCR仪进行qPCR实验。qPCR 20 L扩增体系为:cDNA 模板 2 L,上下游引物(10 mol/L)各0.4 L,ROX
17、染料 II 0.4 L,2TB Green 10 L,RNase-Free 水 6.8 L。qPCR 反应程序:95、30s;95、15 s,60、1 min,95、15 s,40个循环;60、1 min95、15 s。以GAPDH基因mRNA表达水平为参照对数据进行归一化处理,采用2-CT法计算基因的相对表达量。引物使用 PrimerPremier 5.0软件设计后由北京天一辉远生物科技有限公司合成,引物序列(5-3)如下:Survivin,F-GCCCAGTGTTTCTTCTGCTT,R-TCCGCAGTTTCCTCAAATTC;SKP2,F-ATGCCCCAATCTTGTCCATCT,R
18、-CACCGACTGAGTGATAGGTGT;GAPDH,F-ACCCACTCCTCCACCTTTGA,R-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA。1.2.7蛋白提取和Western blot检测ICG-001处理论著癌变畸变突变1 8 9CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期24 h后收集细胞,使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白,使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。按照常规方法进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜上,用5%脱脂牛奶封闭 1 h 后加入一抗 4
19、 孵育过夜。一抗包括:-catenin、SKP2、Survivin、TCF4 和 GAPDH,使用5%脱脂牛奶按11 000进行稀释。使用洗涤缓冲液TBST洗涤3次,每次8 min,加入对应种属的二抗(5%脱脂牛奶按15 000进行稀释),室温摇床孵育1 h,TBST洗涤3次,每次8 min,配制ECL发光液,使用Amersham Imager 800成像仪进行曝光,以GAPDH作为内参对照。1.3统计学分析应用SPSS Statistics 23.0软件对数据进行统计学分析,使用GraphPad Prism 8.0软件进行图片制作。用单因素方差分析法(one-way ANOVA)进行多样本均
20、数的比较。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1ICG-001抑制ESCC细胞的增殖活力CCK-8细胞增殖活力实验结果显示,ICG-001处理24或48 h可抑制ESCC细胞系KYSE410和KYSE450的增殖活力,并呈剂量依赖性(P0.01,图1)。2.2ICG-001抑制ESCC细胞的集落形成能力平板集落形成实验结果显示,50和100 mol/L的ICG-001处理48 h可显著抑制ESCC细胞系KYSE410和KYSE450的集落形成能力(P0.01,图2)。2.3ICG-001诱导ESCC细胞发生G0/G1期阻滞流式细胞术分析结果显示,KYSE410和KYSE450细胞经ICG
21、-001处理24 h后,G0/G1期细胞比例显著增加,S期和G2/M期细胞比例相对降低(图3),提示ICG-001 可 诱 导 ESCC 细 胞 发 生 G0/G1 期 阻 滞(P0.01)。同时,我们也检测了ICG-001处理细胞的凋亡情况,但未见到 ESCC 细胞发生明显凋亡(结果未展示)。2.4ICG-001对-catenin通路相关分子表达的影响qPCR检测结果显示,在ICG-001处理的ESCC细胞中,-catenin/TCF 下游靶分子 SKP2 和 Survivin 的mRNA表达水平与对照组相比显著降低(P0.01),而且可与-catenin结合的转录因子TCF4的mRNA表达
22、水平也明显降低(P0.01,图4)。Western blot检测结果显示,SKP2、Survivin和TCF4的蛋白表达水平均明显下调(P0.01,图5)。A:KYSE410细胞系;B:KYSE450细胞系.*P0.01.图1ICG-001处理24或48 h对ESCC细胞增殖活力的影响A:平板集落形成实验代表图;B:平板集落形成实验结果的统计分析.*P0.01.图2ICG-001处理48 h对ESCC细胞集落形成能力的影响论著癌变畸变突变1 9 0CARCINOGENESIS,TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 20233讨论ICG-001 可以有效抑
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