低鱼粉饲料中黑水虻幼虫粉替...化指标及相关基因表达的影响_肖扬波.pdf
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1、doi:10.7541/2023.2022.0476低鱼粉饲料中黑水虻幼虫粉替代鱼粉对合方鲫生长性能、消化能力、血浆生化指标及相关基因表达的影响肖扬波1 曹申平1 敖 青1 黄 康1 莫郁坚1 张欣然1 郑欣怡1 童晓念1 毛庄文1 樊均德2 刘 臻1 唐建洲1(1.长沙学院生物与化学工程学院,水生动物营养与品质调控湖南省重点实验室,长沙 410022;2.岳阳渔美康生物科技有限公司,岳阳 414100)摘要:实验以合方鲫2号幼鱼(31.500.50)g为实验对象,研究黑水虻幼虫粉(HM)替代饲料鱼粉(0、20%、40%、60%和80%)对合方鲫生长性能、饲料利用、消化能力、血浆生化指标及相关
2、基因表达的影响。实验设计5组等氮(30%)等能(18.50 MJ/kg)等脂(6%)饲料,每组3次重复,每个重复25尾鱼,养殖时间74d。结果表明:增重率和特定生长率随饲料HM含量的升高呈现先升高后降低趋势,且在替代水平为20%时最大;饲料系数呈先降低后升高的趋势,20%替代组显著小于60%和80%替代组(P0.05)。肥满度和脏体比均呈现先升高后降低趋势,且均在40%替代组最大;80%替代组肝体比显著高于0、20%和60%替代组(P0.05),但与40%替代组无显著差异。全鱼水分和灰分无显著变化;20%和60%替代组粗蛋白显著低于0组(P0.05);粗脂肪呈先升高后降低的变化趋势,在20%替
3、代组达到最大值。血浆葡萄糖、总胆固醇含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性无显著差异;血氨含量呈上升趋势,80%替代组显著高于0组;20%替代组血浆总氨基酸含量显著高于其他各处理组(P0.05);60%和80%替代组血浆丙二醛含量显著低于20%替代组(P7.5 mg/L,氨氮0.1 mg/L,pH为6.07.0,光照周期为12L/12D。实验期间,每天于9:00和15:00饲喂实验鱼至表观饱食,养殖时间74d。1.31.3 样品采集在实验结束后,禁食24h,分别捞出每缸实验鱼,经60 mg/L MS-222麻醉后准确称量每缸实验鱼总表 1 饲料配方及化学组成(%干物质)Tab.1 formula a
4、nd chemical composition of diets(%dry matter)原料Ingredients(%)SP0SP20SP40SP60SP80鱼粉 Fish meal10.00 8.00 6.00 4.00 2.00豆粕 Soybean meal32.0032.0032.0032.0032.00菜粕 Rapeseed meal16.3016.3016.3016.3016.30黑水虻幼虫粉 HM0 3.30 6.60 9.9013.20鱼油 Fish oil 2.95 2.50 2.05 1.57 1.12豆油 Soybean oil 2.95 2.50 2.05 1.57 1
5、.12玉米淀粉 Corn starch 8.00 8.50 9.1010.0010.50面粉 Flour18.0018.0018.0018.0018.00胆碱 Choline 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50多维多矿预混物Premix1 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00羧甲基纤维素Carboxymethylcellulose 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00纤维素 Cellulose 4.30 3.40 2.40 1.16 0.26化学组成 Chemical composition水分 Moisture(%)8.38 8.77 8.84 9.23
6、 8.73灰分 Ash(%)8.06 7.81 7.38 7.54 7.44粗脂肪 Crude lipid(%)5.39 5.44 5.57 5.81 6.79粗蛋白 Crude protein(%)30.4029.8030.1028.8029.00能量 Energy(MJ/kg)18.5118.5018.5018.5318.51注:1多维多矿预混物(mg/kg饲料):维生素B12,0.02;叶酸,5;泛酸钙,50;肌醇,100;烟酸,100;生物素,0.1;维生素B1,20;维生素B2,20;维生素B6,20;维生素A,11;维生素D,2;维生素E,50;维生素K,10;维生素C,100;纤
7、维素,3412;磷酸二氢钙,7650.6;硫酸亚铁,2286.2;乳酸钙,1750.0;硫酸锌,178.0;氯化钠,500.0;硫化镁,8155.6;磷酸二氢钠,12500.0;磷酸二氢钾,16000.0;硫酸锰,61.4;硫酸铜,15.5;硫酸钴,0.91;碘化钾,1.5;亚硒酸钠,0.60;玉米淀粉,899.7Note:1Premix(mg/kg diet):Vitamin B12,0.02;folic acid,5;calcium pantothenate,50;inositol,100;niacin,100;biotin,0.1;Vitamin B1,20;Vitamin B2,20;
8、Vitamin B6,20;Vitamin A,11;Vitamin D,2;Vitamin E,50;Vitamin K,10;Vitamin C,100;cellulose,3412;CaH2PO42H2O,7650.6;FeSO47H2O,2286.2;C6H10CaO65H2O,1750.0;ZnSO47H2O,178.0;NaCl,500.0;MgSO47H2O,8155.6;NaH2PO42H2O,12500.0;KH2PO4,16000.0;MnSO4H2O,61.4;CuSO45H2O,15.5;CoSO47H2O,0.91;KI,1.5;Na2SeO3,0.60;corn s
9、tarch,899.71364水 生 生 物 学 报47 卷重,记录实验鱼尾数;每缸取2尾鱼抹干称重后于20保存以待全鱼常规营养成分分析;每缸取2尾鱼抹干称重后,测量体长和体重,计算肥满度;将2尾鱼分别解剖后分离出内脏团和肝脏组织并称重,计算脏体比和肝体比;使用2 mg/mL肝素钠溶液润洗注射器和离心管,每缸取6尾鱼使用注射器于冰上通过尾静脉抽血并存于经肝素钠润洗过的1.5 mL离心管中,在4条件下4500 r/min离心10min获取血浆样品,将离心管中的血浆分装在0.2 mL的离心管中用于血浆成分分析;每缸取2尾鱼于冰上解剖,依次分离出肝胰脏和肠道组织并立即置于液氮中暂存,取样结束后放于8
10、0保存以待相关酶活性检测和相关基因表达分析。1.41.4 常规营养成分检测全鱼预处理:对实验鱼称重后将其放入高压蒸汽灭菌锅中于121蒸煮20min,冷却后捣碎,再于75烘干,称重并计算全鱼水分含量,然后用粉碎机粉碎,以用于全鱼常规营养成分检测。实验饲料与实验鱼的常规营养组成参照AOAC(2000)方法进行测定:水分含量采用105干燥恒重法进行测定;灰分含量采用马弗炉550灼烧法测定;粗脂肪含量采用索氏提取法进行测定;粗蛋白含量采用凯氏定氮法进行测定。1.51.5 肠道酶活与血浆生化成分检测肠道中碱性磷酸酶(AKP)、胰蛋白酶活性,血浆中葡萄糖(GLU)、血氨(PA)、总氨基酸(TAA)、总蛋白
11、(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、丙二醛(MDA)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定,检测方法请参见相关试剂盒说明书。1.61.6 基因表达分析组织中各基因表达水平使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR,Bio-Rad,Hercules,USA)进行分析。使用AG RNAex Pro Reagent试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)提取肠道和肝脏组织总RNA,使用全波长读数仪(Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)检测RNA浓度和纯度,使用Evo M-MLV RT MixKit试剂盒(湖
12、南艾科瑞生物工程有限公司)对RNA进行逆转录以获得cDNA。实验以-actin作为内参基因,根据NCBI数据库中各基因序列,使用PrimerPremier 5软件分别设计引物,委托擎科生物科技有限公司合成引物,引物序列见表 2。qRT-PCR反应体系(16 L)如下:2 SYBR Green ProTaq HS Premix(湖南艾科瑞生物工程有限公司)8 L,正反引物各0.64 L,cDNA模板1 L,ROX Reference Dye(20 mol/L)0.32 L,ddH2O 5.4 L。扩增程序:95预变性10min;95 15s,60 1min,进行40个循环。qRT-PCR数据使用
13、2Ct方法16进行分析。1.71.7 计算公式鱼体增重率(Weight gain rate,WGR)、特定生长率(Specific growth rate,SGR)、饲料系数(Feedconversion ratio,FCR)、摄食率(Feeding rate,FR)、存活率(Survival rate,SR)、肥满度(Condition factor,CF)、肝体比(Hepatopancreas somatic index,HSI)、脏体比(Viscerosomatic index,VSI)、氮储存效率(Nitrogen retention efficiency,NRE)和总氮排放量(Tot
14、al nitrogen waste,TNW)等指标的计算方法参照如下:增重率(%)=(终末体重初始体重)/初始体重100;特定生长率(%/d)=100ln(终末体重)ln(初始体重)/投喂天数;饲料系数(FCR)=饲料摄入量/(终末体重初始体重);摄食率(%BW/d)=100饲料摄入量/投喂天数(初始体重+终末体重)/2;存活率(%)=100实验终末鱼体数/实验初始鱼体数;肥满度(g/cm3)=100终末体重/终末体长3;肝体比=100肝胰脏重/鱼体重;表 2 实时荧光定量PCR扩增引物序列Tab.2 qRT-PCR primer sequence基因Gene引物序列Primer sequen
15、ce(53)-actinGAAACTGGAAAGGGAGGTAGCCTGTGAGGGCAGAGTGGTAGAtorTCAGGGTTGTCAGCGTATTGAGGGTTTTATGGGCTAGTGCigf1ATTGCCCGCATCTCATCCTCTGACCGCTAGACATCCCCTTghCGCGTCTCTTTTCGCCTTATTTGCCTGGATGAGCACACTGAghrACCCACAACACGCAAGTCTGTTTACTGCCCTGTGCTCCasct2GAACACTGTGCTGTCTGGAGGTACTTGGGTTGGTCGTTTGAATCpept1CAGGTTTGTGAATGGCTTTAC
16、CTGTGGATGTCGTTCGGGTTAlat2TCTGTTCCCCACCTGCTTCCCCCTGTAGAAATGCTAATGCGcdx2GAACCCTCAGAATTTTGTACCCGR:GGTAATTCCAGGGACGTGATG9 期肖扬波等:低鱼粉饲料中黑水虻幼虫粉替代鱼粉对合方鲫生长性能、消化能力、血浆生化指标及相关基因表达的影响1365脏体比=100内脏重/鱼体重;氮储存效率(%)=100(终末体重终末鱼体粗蛋白含量初始体重初始鱼体粗蛋白含量)/(饲料摄入量饲料粗蛋白含量);总氮排放量(g/kg增重)=1000(饲料摄入量饲料粗蛋白含量)(1NRE)/(终末体重初始体重)6.25。1
17、.81.8 统计分析使用SPSS 19.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA),通过Levene检验对数据进行方差同质性分析,然后使用Duncan氏法进行多重比较,P0.05表示差异显著;实验结果均采用“平均值标准误”(meanSE)表示。2 2 结果 2.12.1 生长性能饲料中黑水虻幼虫粉添加水平对实验鱼存活率无影响;增重率和特定生长率随饲料中黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的升高呈现先升高后降低的趋势,且在SP20组有最大值;饲料系数呈先降低后升高的趋势,SP20组有最小值,且SP20组饲料系数显著小于SP60和SP80处理组(P0.05)。各组摄食率相对SP0组均有上
18、升趋势,在SP40组有最大值(表 3)。2.22.2 形体指标在本实验中,实验鱼的肥满度随饲料中黑水虻幼虫粉添加比例的升高而先升高后降低,肥满度在SP40组达到最大值,而在SP80组有最小值,SP60和SP80组肥满度显著低于SP40组(P0.05);脏体比呈先升高后降低趋势,SP40组有最大值且显著高于SP0组;在SP0至SP60组间,实验鱼肝体比随饲料中黑水虻幼虫粉添加比例增加呈现先升高后降低趋势,但随着黑水虻幼虫粉进一步的提高,SP80组肝体比显著高于SP60、SP20和SP0组(P0.05;表 4)。2.32.3 全鱼常规营养成分随着饲料中黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的增加,各处理组实验鱼
19、的水分和灰分含量无显著影响;SP20和SP60组实验鱼粗蛋白显著低于SP0组(P0.05);粗脂肪呈先升高后降低的变化趋势,且在SP20组有最大值,在SP80组有最小值,SP20组显著高于SP0和SP80组(P0.05;表 5)。表 3 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对合方鲫生长性能的影响Tab.3 Effects of substituting fish meal with HM on growth performance of HCC指标IndexSP0SP20SP40SP60SP80初重IBW(g/尾)31.600.2931.300.2331.430.4331.930.1831.170.23末重F
20、BW(g/尾)50.230.5250.571.2050.270.9449.430.5249.271.39增重率WGR(%)59.002.6561.522.6859.800.8954.811.8358.014.05特定生长率SGR(%/d)0.630.020.650.020.640.010.590.020.620.03饲料系数FCR2.670.08ab2.610.03a2.790.06ab2.850.05b2.850.07b摄食率FR(%BW/d)1.640.051.660.031.740.041.650.021.720.05存活率 SR(%)1000.001000.001000.001000.
21、001000.00注:表中数据表示为平均值标准误,同行数值不同上标英文字母表示差异显著(P0.05);下同Note:Data are meansSE.Values in the same row with different superscript letters are significantly different(P0.05);the sameapplies below表 4 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对合方鲫形体指标的影响Tab.4 Effects of substituting fish meal with HM on morphology indexes of HCC指标IndexSP0
22、SP20SP40SP60SP80肥满度CF(g/cm3)3.440.06ab3.430.12ab3.630.05b3.290.04a3.320.10a脏体比VSI14.090.27a15.521.03ab16.900.19b15.671.09ab15.510.12ab肝体比HSI3.200.28a3.490.28ab4.510.46bc3.940.12ab5.330.53c表 5 黑水虻幼虫粉替代鱼粉对合方鲫鱼体常规营养成分的影响Tab.5 Effects of substituting fish meal with HM on body composition of HCC指标IndexSP
23、0SP20SP40SP60SP80水分Moisture(%)70.480.2370.830.8570.651.0072.650.4371.651.44灰分Ash(%)3.250.183.050.113.160.103.230.033.090.02粗蛋白Crude protein(%)15.460.65c13.330.50a14.420.22abc13.680.22ab14.850.07bc粗脂肪Crude lipid(%)8.360.21a11.640.69b10.781.55ab9.000.03ab7.791.28a1366水 生 生 物 学 报47 卷 2.42.4 肠道消化酶活性肠道碱性
24、磷酸酶活性随饲料中黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的升高呈现升高趋势,但各处理组间无显著差异;胰蛋白酶活性在各组间的差异不显著(表 6)。2.52.5 血浆生化指标各组间血浆葡萄糖、总胆固醇含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性无显著差异;血氨含量随饲料中黑水虻幼虫粉替代鱼粉比例的升高而持续增加;血浆总氨基酸含量在SP20组有最大值,且SP20组显著高于其他各处理组(P0.05);血浆总蛋白含量在SP0组最高,且SP0组显著高于各实验组(P0.05);甘油三酯出现先升高后降低趋势,SP40组显著高于SP80组(P0.05);血浆中丙二醛含量在高水平黑水虻幼虫粉组也出现下降趋势,SP60和SP80组丙二醛含量
25、显著低于SP20组(P0.05,表 7)。2.62.6 肠道与肝脏基因表达分析黑水虻幼虫粉替代饲料中鱼粉显著影响实验鱼肠道基因表达(图 1)。SP40组肠道中谷氨酰胺转运白2(Alanine,Serine,Cysteine transporter 2,asct2)基因表达水平显著高于SP0组(P0.05),而SP20、SP60和SP80组与SP0组无显著差异;L型氨基酸转运蛋白2(L-type amino acid transporter 2,lat2)基因在SP20组有最高表达量,其次是SP40组;小肽转运蛋白1(Oligopeptide transporter 1,pept1)基因表达水平
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