多光谱方法结合理论计算探究...1与亚胺培南之间的相互作用_张椰莉.pdf
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1、第 卷,第期 光谱学与光谱分析 ,年月 ,多光谱方法结合理论计算探究金属内酰胺酶 与亚胺培南之间的相互作用张椰莉,程建伟,董晓婷,边六交太原师范学院生物系,山西 晋中 西北大学生命科学学院,陕西 西安 太原师范学院地理科学学院,山西 晋中 摘要金属内酰胺酶()可以水解几乎所有的内酰胺类抗生素,这是导致细菌感染治疗中产生耐药性的主要机制。迄今为止,由于缺乏临床批准的抑制剂,这已成为全球关注的问题。最近来自粘质沙雷氏菌的 被发现是一种新型的 亚类,它可以灭活几乎所有含内酰胺环的抗生素。为了明确 与内酰胺类抗生素的特异性分子识别和作用机制,采用内源性荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱及分子对接方法
2、对碳青霉烯类抗生素亚胺培南()与金属内酰胺酶 之间的相互作用机制进行探究。猝灭光谱结果表明 可以使 内源性荧光猝灭,且猝灭机制为动态和静态组合猝灭,其中静态猝灭为主,结合常数为 (),表明两者之间具有很强的结合力;根据 方程得出结合过程中的热力学参数,说明两者的结合是由焓变和熵变共同驱动的,且氢键和范德华力为主要作用力;同步荧光结果中,随着 浓度的增加,最大发射波长均发生蓝移 和 ,表明 和 残基参与 与 的结合过程;三维荧光光谱中 加入后,的 和 强度显著降低,表明 与 作用之后的微环境和构象发生了改变,与同步荧光结果一致。分子对接结果中 的内酰胺环进入 的结合口袋,而侧链因空间位阻效应位于
3、活性口袋的外部,表明 主要是识别 的核心结构,与其 侧链的作用较弱;与 参与作用的氨基酸残基包括 ,和 ,表明这些氨基酸残基与活性部位的两个锌离子是设计具有强亲和力的 抑制剂的关键因素;结合自由能也为负值,表明两者的结合是一个自发放热的过程,与荧光结果一致。该研究提供了对 与 的识别和结合的见解,可能有助于设计内酰胺酶新底物和开发对超级细菌具有抗性的新抗生素。关键词金属内酰胺酶;亚胺培南;荧光光谱;分子对接;相互作用中图分类号:文献标识码:()收稿日期:,修订日期:基金项目:国家自然科学基金项目(),山西省基础研究计划项目()资助作者简介:张椰莉,女,年生,太原师范学院生物系讲师 :通讯作者
4、:引言近年来,致病性“超级细菌”中金属内酰胺酶(,)的出现,已引起了人们极大的关注。它能够使绝大多数的内酰胺类抗生素失效,包括碳青霉烯抗生素,进而使细菌产生耐药性演变为“超级细菌”。因此,研究金属内酰胺酶与抗生素的作用机制是解决细菌耐药性的前提。依据序列相似性和锌结合模式,金属内酰胺酶分为三个子类,和,其中,是单锌酶,活性位点只需要个锌离子参与,而 和 是双锌酶,活性位点需要个锌离子维持。虽然序列彼此之间同源性有差异,但是它们几乎可以水解全部的内酰胺类抗生素,且目前临床上没有显著的抑制剂被报道,已逐渐威胁到全球人类的生命健康。金属内酰胺酶 作为 亚类的新成员,据报道从肠杆菌粘质沙雷氏菌()中鉴
5、定出来,其对头孢菌 素和碳 青 霉 烯类抗 生 素 均具 有 高 效 的 催 化 活性。锌离子活性位点与其他 成员一致,结合位点由 、和 组 成,结 合 位 点 、,和 组成,其中锌配位的 作为亲核试剂,促进催化水解反应的发生。等通过量子力学和分子动力学组合模拟了 与氨苄西林的水解过程得出内酰胺开环反应会生成保守的氮阴离子中间体,在 所 得 的 氮 阴 离 子 和 之 间 形 成 新 的 连 接。等解析 与水解的碳青霉烯类抗生素的复合物,得出水解机制,但是未进行水解前的物理识别过程,即结合过程中的分子识别和相互作用的研究。尽管 的晶体结构已被解析,但是与抗生素复合物的晶体结构还未获得。因此,通
6、过了解 和底物抗生素之间的分子识别机制,可能对进一步研发 抑制剂具有重要意义。本研究选取亚胺培南为(,)碳青霉烯类抗生素的代表,联 合 使 用 光 谱 学 和 分 子 对 接 方 法,探 讨 了 与 之间的相互作用机制,也为未来新型抗生素药物的开发提供一些参考和启发。图 的活性口袋()和亚胺培南结构式()()()实验部分 试剂与仪器金属内酰胺酶(西北大学边六交教授实验室提供),亚胺培南(美国 公司),、和 均为分析纯,实验用水为均去离子水。荧光分光光度计(美国安捷伦公司),型 值测定仪(上海雷磁有限公司),分析天平(瑞士梅特勒托利多公司),型精细电子天平(美国 :公司),型制冰机(河南天驰卓达
7、有限公司),酶标仪(宝特)。方法 溶液配制缓冲液:配置 磷酸盐溶液()和 溶液,室温保存。储备液:用缓冲液配制浓度为 的 储备液,保存备用。亚胺培南()储备液:用缓冲液配制浓度为 的 储备液,分装保存备用。与 相互作用的猝灭荧光光谱测定将 储备液置于 石英比色皿中提前预冷,并添加不同浓度的 溶液,使 与 的最终浓度之比分别为,和。在激发波长 处测定不同温度 、和 下的猝灭荧光,参数设置如下:激发和发射狭缝宽度均为 ,扫描速度 ,扫描范围 ,电压 。以 缓冲液和不同浓度亚胺培南为空白对照,每个样品重复测量三次。与 相互作用的同步荧光光谱测定将 溶液()置于 石英比色皿中提前预冷,并添加不同浓度的
8、 溶液,使 与 的最终浓度之比分别为,和 ,加样总体积尽量小于 。分别在为 和 下进行同步荧光测定,扫描参数设置如上,扫描范围 。与 相互作用的三维荧光光谱测定分别测定 与 复合物的三维荧光光谱,与 终浓度比为,其中参数设置如下:激发和发射波长扫描范围分别为 和 ,记录波长间隔为,其余参数设置同上。与 之间的分子对接研究 的 晶 体 结 构()是 从 蛋 白 质 数 据 库(:)获 得 的,的 结 构 来 自 于 数据库(:)。在分子对接之前,中水分子和杂原子通过 软件进行处理,结构通过 软件实现能量最小化和质子化。采用 程 序 展 开 对接,通过 半 柔 性 对 接 方 法 和 遗传算法预测
9、 与 的相互作用信息。基于合理的结合位点和最小的结合自由能选择最佳的结合构象,并对其采用 和 软件进行可视化作图。结果与讨论 猝灭荧光光谱测定 等报道了,在 下,与 相互作用时 的为 ,为 ,()为 ,表明在此温度下 对 的水解效率较低。因此,可通过降低温度来降低水解速光谱学与光谱分析第 卷率,从而延长分子识别时间(物理反应)和水解时间(化学反应)。基于此背景,本研究在 和 内完成荧光光谱的测定,且在实验过程中,过量,与 一直处于互作状态,可认为实际测定的光谱数据来自于 与 的复合物。因此,荧光光谱分析可用于分析 与 之间的相互作用。分子中含有个 、个 和个 ,这些氨基酸残基使得其产生很强的内
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