含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析_陈宇翔.pdf
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1、第 37 卷第 2 期2023 年 4 月南华大学学报(自然科学版)Journal of University of South China(Science and Technology)Vol.37 No.2Apr.2023收稿日期:20221130基金项目:湖南省自然科学基金资助项目(2018JJ2330);湖南省教育厅科学研究项目(16B223)作者简介:陈宇翔(1997),男,硕士研究生,主要从事土壤污染防控理论与技术方面的研究。E-mail:1045791195qqcom。*通信作者:邓钦文(1981),男,副教授,博士,主要从事环境修复理论与技术方面的研究。E-mail:dengq
2、w usceducnDOI:10.19431/ki.16730062.2023.02.003含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析陈宇翔1,2,3,周天豪1,2,3,张豪杰1,2,3,李珂淼3,吴同3,谭劲龙1,2,3,邓钦文1,2,3*,杨帆4(1南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室,湖南 衡阳 421001;2南华大学 衡阳市土壤污染控制与修复重点实验室,湖南 衡阳 421001;3南华大学 资源环境与安全工程学院,湖南 衡阳 421001;4衡阳市生态环境局衡南分局,湖南 衡阳 421001)摘要:采集含铀凋落物腐解前后土壤样本,通过 Illumina Miseq 高通量
3、测序技术研究腐解前后土壤微生物的多样性及群落结构,解析含铀凋落物腐解前后土壤微生物群落结构特征及其变化规律,为发掘潜在含铀生物质降解菌种提供理论基础。通过高通量测序,分别获得 158 781 条细菌和 242 198 条真菌的有效序列,菌群 Alpha 分析显示,腐解后细菌的多样性和丰富度增加,真菌的多样性和丰富度减少。通过微生物群落结构解析,发现腐解前后门水平上始终存在的优势菌群,细菌中为绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和变形菌门(Pro-teobacteria);真菌中为子囊菌门(Ascomycota)、担
4、子菌门(Basidiomycota)、unclassified_Fungi 和被孢囊门(Mortierellomycota)。结果表明,含铀凋落物腐解后,凋落物内的铀被释放到土壤中,改变了土壤微生物群落结构。腐解后土壤中可识别的优势菌群功能主要集中在对纤维素、半纤维素、木质素的降解和铀的浸出。热酸菌属(Acidother-mus)和软盘菌属(Mollisia)可能是降解凋落物和浸出铀较好的微生物组合。关键词:铀;凋落物;腐解;高通量测序;微生物群落结构中图分类号:X53文献标志码:A文章编号:16730062(2023)02001808Analysis of Structural Charac
5、teristics and Diversity of MicrobialCommunities Before and After Decomposition of Uranium-Containing LitterCHEN Yuxiang1,2,3,ZHOU Tianhao1,2,3,ZHANG Haojie1,2,3,LI Kemiao3,WU Tong3,TAN Jinlong1,2,3,DENG Qinwen1,2,3*,YANG Fan4(1Key Discipline Laboratory for National Defense for Biotechnology in Urani
6、um Mining andHydrometallurgy,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2Hengyang Key81第 37 卷第 2 期陈宇翔等:含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析2023 年 4 月Laboratory of Soil Pollution Control and emediation,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;3School of esources Environment and Safety Eng
7、ineering,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;4Hengnan Branch of HengyangEcological and Environmental Bureau,Hengyang,Hunan 421001,China)Abstract:Soil samples were collected before and after decomposition of uranium-containingapoplast,and the diversity and community structure of soi
8、l microorganisms before and afterdecomposition were studied by Illumina Miseq high-throughput sequencing technology toanalyze the structural characteristics of soil microbial communities before and after decom-position of uranium-containing apoplast and their change patterns,and to provide a theo-re
9、tical basis for the discovery of potential uranium-containing biomass degrading speciesHigh-throughput sequencing was performed to obtain 158 781 bacterial and 242 198 fungalsequences Alpha analysis of the bacterial community showed that the diversity and abun-dance of bacteria increased and that of
10、 fungi decreased after decomposition Microbial com-munity structure analysis revealed that the dominant groups consistently present at the phy-lum level before and after decay were Chloroflexi,Actinobacteria,Acidobacteria and Pro-teobacteria in bacteria,and Ascomycota,Basidiomycota,unclassified_Fung
11、i,and Mor-tierellomycota in fungi The results showed that with the decomposition of uranium-contai-ning apoplast,uranium within the apoplast was released into the soil and changed the soilmicrobial community structure The functions of the dominant group of identifiable bacteriain the soil after deco
12、mposition were mainly focused on the degradation of cellulose,hemi-cellulose and lignin,and leaching of uranium Acidothermus spp and Mollisia spp may bethe better microbial assemblages for degradation of litter matter and leaching of uraniumkey words:uranium;plant residues;decay;high-throughput sequ
13、encing;microbial commu-nity structure0引言铀是一种放射性核素,会引起许多有害影响,是一种严重的环境污染物,因其化学毒性和放射性毒性对植物、动物和微生物造成重大损害,并通过食物链累积对人类健康造成严重危害而引起了广泛关注1。近年来,植物修复因其能高效、低成本地去除或稳定重金属,降低重金属毒性而受到广泛关注。但是植物修复会产生大量含重金属的生物质,这些受污染植物的处置是植物修复广泛应用的限制因素之一2,如果处置不当,势必会对环境造成二次污染。正在使用几种富含重金属的生物质的处理方法,包括热解、焚烧、堆肥和压实,他们虽然有效,但大多存在成本过高且不安全的问题3。
14、其中通过微生物处理进行含重金属生物质的降解和污染控制,具有成本低、绿色环保等特点,在研究中受到广泛地重视。微生物处理法是一种通过微生物稳定化和有机物腐殖化处理生物质的技术4。使用微生物对生物质或有机物的生物降解是一种常见方法,已有多年报道。据报道,白腐(white-rot)真菌通过矿化木质素,对木质素降解5。黑曲霉(Asper-gillus niger)是许多植物的危险病原体,它是植物组织破坏、腐烂和分解的主要原因之一6。此外,变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chlo-roflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)都是与凋
15、落物分解密切相关的菌群7。细菌和真菌群落已被证明参与了凋落物分解中的一系列演替过程。LHJing 等8 研究了8 种不同微生物从富含铀的植物中降解和释放铀的能力,通过在铀胁迫下的生长来评估他们降解生物质的能力,发现真菌的降解能力优于细菌,而细菌的金属浸出能力更好。以上研究表明,通过分析微生物群落结构及变化,有助于发掘有降解生物质和除铀功能的微生物,从而控制环境污染。但目前国内尚缺少对91第 37 卷第 2 期南华大学学报(自然科学版)2023 年 4 月含铀生物质腐解前后土壤中微生物群落深入分析的报道。因此,本研究通过高通量测序技术,探究含铀凋落物分解前后微生物群落特征的变化和多样性,将有助于
16、更好地了解在微生物协同处理含铀凋落物时,各优势菌群的降解能力和铀释放能力,以期发掘潜在含铀生物质降解菌种。1材料与方法11样品采集与处理本试验土壤取于南华大学校内西山山脚,土壤采集后经干燥、过筛等前处理以供土壤基本理化性质分析,土壤基本理化性质见表 1。试验在南华大学温室大棚中进行,大棚温度维持在 25 左右,试验植物选用南华大学植物大棚中经铀富集试验后的合果芋,铀质量比为 43.12 mg/kg。将采集后的植物用去离子水冲洗净后,置于通风处风干,在装袋前将其切成 510 cm左右的小段,取风干后的植物 10 g 装入 15 cm15 cm 的 0.165mm孔径尼龙网袋中,并往网袋中添加 1
17、00 g土壤混合均匀,埋入土壤中,于 21 d 后取出网袋对土壤进行微生物群落的测试。通过电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spec-trometry,ICP-MS)测定凋落物和水样中的铀质量浓度。表 1土壤理化性质Table 1Physical and chemical properties of soil参数值pH685有机质/%511碱解氮/(mgkg1)8715速效磷/(mgkg1)50912DNA 提取、PC 扩增和高通量测序采用 Omega 公司的 Mag-bind soil DNA kit 试剂盒提取土壤总 DNA,同时采用
18、Nanodrop 对DNA 进行定量,并通过质量浓度为 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量。细菌引物为:338F-806(5-ACTCCTACGGGAGGCACAGG-3);真菌 引 物 为:SSU0817F-1196(5-TTAGCATG-GAATAATAATAGGA-3)。并添加样本特异性Barcode 序 列,从 而 对 核 糖 体 NA(ribosomalNA,rNA)基因可变区或特定基因片段进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PC)扩增。之后进行扩增产物的荧光定量,并且根据荧光定量的结果,按照每个样本的测序量需求,对各样本按相应比例混合,
19、并振荡均匀。测序文库制备后,梯度稀释合格的文库,根据所需测序量按相应比例混合,并变性为单链后使用 MiSeq 测序仪进行双端测序。将 4 个微生物测序所得的序列上传到国家微生物科学数据中心,获得接受号分别为 NMDC40025391、NMDC40025392、NMDC40025393和 NMDC40025394。13生物信息学和统计分析首先根据序列质量对测序所得的原始下机数据进行初步筛查,重测、补测问题样本。把测序所得的 eads 通过分析软件 QIIME2(20194)中进行处理。得到特征序列后,对形成的特征表构建稀疏 曲 线,并 计 算 Chao1、Observed _ species、S
20、impson、Shannon 和 Good s coverage 这 5 种常用的 Alpha 多样性指数。同时对每个扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASV)的特征序列进行物种注释。其中细菌的 16S rNA 基因,选用Greengenes 数据库。真菌 ITS 序列,选用 UNITE数据库。对参考序列缺少准确的物种信息,以unidentified 标记;对因测序读长的限制,具体的种、属之间无法鉴别分开的,以 unclassified 标记。统计各样本在门和属水平上的物种组成信息,并绘制门水平上微生物的群落构成图和属水平的群落聚类热图。2结果与讨论21样本
21、序列信息及微生物构成含铀凋落物经过 21 d 的腐解,凋落物内的铀被释放出来,导致土壤铀质量比从 0 mg/kg 上升为 4.96 mg/kg。通过对土壤样品的 DNA 进行MiSeq 高通量测序,4 个样品原始序列量共 546 757个,使用 DADA2 方法对原始序列进行分析,经过质控、去噪、拼接、去嵌合体后,获得高质量序列量共 403 090 个,最后去除 2 111 个 single-tons ASV(在全体样本中,序列总数仅为 1 的ASV)得到 400 979 个有效序列(表 2)。对于每个ASV 的特征序列,在 QIIME2 软件中使用预先训练好的 Naive Bayes 分类器
22、进物种注释,细菌分类为 24 个门、58 个纲、122 个目、191 个科、308 个属、558 个种;真菌分类为 11 个门、31 个纲、64 个目、128 个科、166 个属、203 个种。02第 37 卷第 2 期陈宇翔等:含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析2023 年 4 月表 2细菌与真菌高通量测序结果Table 2Bacterial and fungal high-throughputsequencing resultsSample ID原始序列量高质量序列量 非单例序列量B0132 00278 98077 913B21132 47381 91280 868F0135
23、 723114 084114 084F21146 559128 114128 114注:B0 为含铀凋落物腐解前的细菌组;B21 为含铀凋落物腐解后的细菌组;F0 为含铀凋落物腐解前的真菌组;F21 为含铀凋落物腐解后的真菌组。选用稀疏曲线可以预测样本在一系列给定的测序深度下,所可能包含的物种总数及其中每个物种的相对丰富度。曲线的平缓程度反映了测序深度对于观测样本多样性的影响大小,曲线越平缓,表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性,继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新 ASV;反之,则表明 alpha 多样性尚未接近饱和。如图 1 所示,4 个组的稀疏曲线均呈先直线上升随后均趋
24、于平坦,并且样本的测序覆盖度均在 99%以上(见表 3),说明样本中未被检测出的物种所占的比例很少,本次测序结果能较好地反映样品中微生物的真实情况。图 1含铀凋落物腐解前后土壤微生物的稀疏曲线Fig1Sparsity curves of soil microorganisms before and after decomposition of uranium-containing decay22微生物 Alpha 多样性分析通过单样本分析得出微生物群落的丰富度和多样性的总体结论是生物科学中被广泛接受的做法,包括一系列多样性指数(Chao、ACE、Simpson、coverage)估计群落环境的
25、物种丰富度和多样性9。其中 Chao1 和 Observed_species 指数均表征群落中物种的丰富度,指数越大,群落的丰富度越高。Shannon 和 Simpson 指数均表征微生物群落的多样性,指数值越高,群落的多样性越高。其中 Shannon 指数更适用于复杂群落;而 Simpson 指数更适用于简单群落。本试验中,B21 组的 4 个指数均大于 B0 组,而 F21 组的 4 个指数均小于 F0 组(表 3),可以得出在腐解后,细菌的物种丰富度和多样性也在增加,而真菌的却在减少,并且细菌的物种丰富度和多样性都比真菌要高,说明细菌可能是微生物在含铀凋落物腐解过程中的主要组成部分。研究
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