杜仲叶胶颗粒形态、脂肪酸组成及胶分子量季节变化_刘萍.pdf
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1、doi:10.11707/j.1001-7488.LYKX20210692杜仲叶胶颗粒形态、脂肪酸组成及胶分子量季节变化*刘萍谢宇峰袁婷贡献秦利军(贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵阳 550025)摘要:【目的】解析杜仲胶颗粒形态、膜脂肪酸组成及杜仲胶分子量的季节变化规律,分析胶颗粒形态差异和脂肪酸组成与杜仲胶分子量的相关性,为进一步阐明杜仲胶颗粒生物学功能、揭示杜仲胶合成机制提供参考。【方法】以10 年树龄杜仲成株新枝上 611 月叶片胶颗粒为材料,利用光镜和电镜观察不同生育期叶片杜仲胶颗粒形态差异,结合气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分
2、析胶颗粒脂肪酸组成与含量变化以及利用分子排阻色谱(SEC)测定杜仲胶特征参数,探讨杜仲胶颗粒形态与胶颗粒脂肪酸组成以及杜仲胶分子量和分子量分布间的相互联系。【结果】1)叶片胶颗粒粒径总体表现为随月份推移而逐渐增大。6 月份平均直径为 3.99 m,到 11 月份时增加到 6.7 m。小胶颗粒(d5 m)数量占比从 6 月份的 65.91%降至 11 月份的 19.09%,而大胶颗粒(d5 m)数量占比从 6 月份的 34.09%增至 11 月份的80.91%;2)脂肪酸测定表明,8、10、11 月份叶片杜仲胶颗粒中分别检测到 26、30 和 26 种脂肪酸,且有 15 种饱和脂肪酸相同,以棕榈
3、酸(C16:0)含量最高,二十四碳酸(C24:0)次之。同时,发现有 7 种不饱和脂肪酸为 10 月份特有,而 3 种不饱和脂肪酸(肉豆蔻油酸(C14:1)、反式亚油酸(C18:2n6t)和-亚麻酸(C18:3n3)为 8 和 10 月份特有;3)杜仲胶特征参数测定表明,叶片中杜仲胶分子量的分布峰在 6、7、8、9、10、11 月份分别有 3、6、6、3、5、3 个。另外,611 月份的杜仲胶分子量分布值变化在 2.186.00,说明叶片中杜仲胶分子量在 6 月份差异小、分布集中,而在 11 月份差异大、分布零散。【结论】杜仲胶颗粒的粒径随月份推移逐渐增大,且大粒径占比逐渐升高。不同月份杜仲胶
4、颗粒中除含有少数对生育期有依赖的特有脂肪酸。杜仲胶分子量随月份推移而增加并趋于稳定,且早期(68 月)以分子量差异不大的胶分子居多,而后期(911 月)以分子量差异较大的胶分子居多。关键词:杜仲;胶颗粒;形态;脂肪酸组成;分子量中图分类号:S718.43文献标识码:A文章编号:10017488(2023)04005711Seasonal Dynamics of Morphology,Fatty Acid Composition and Molecular Weight of Gum Particlesin Eucommia ulmoides LeavesLiu PingXie YufengYu
5、an TingGong XianQin Lijun(Key laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)College of Life Sciences/Institute ofAgro-Bioengineering,Guizhou UniversityGuiyang 550025)Abstract:【Objective】In this study,the seasonal variation in particle
6、morphology,membrane fatty acid composition andmolecular weight of gutta-percha was investigated,and the correlation between particle morphology,and fatty acid compositionand molecular weight of gutta-percha was also analyzed,which would lay a theoretical foundation for further elucidating thebiologi
7、cal function of Eucommia ulmoides gum particles and revealing the mechanism of E.ulmoides gum synthesis.【Method】The rubber particles from leaves growing on the new branches of 10-year-old E.ulmoides were collected from June toNovember,and the morphological differences of rubber particles at differen
8、t growth stages were observed by using lightmicroscope and electron microscope,and the composition and content of fatty acid in rubber particles were also analyzed by gaschromatography-mass spectrometry(GC-MS).Meanwhile,the characteristic parameters of rubber particles were determined bysize-exclusi
9、ve chromatography(SEC).The relationships between the morphology,fatty acid composition of rubber particles,aswell as molecular weight and molecular weight distribution of rubber particles were investigated.【Result】1)The results showedthat the rubber particles size in E.ulmoides leaves increased grad
10、ually with the passage of months(from June to November),andthe average diameter was 3.99 m in June and increased to 6.7 m in November.The proportion of small rubber particles(d99%,Sigma-Aldrich);专用于色谱分析的所有溶剂和试剂均为分析纯,购自 Systerm(马来西亚);正己烷中的酯化剂TMS-DM(2M)购 自 Sigma-Aldrich 公 司。四 氢 呋 喃(tetrahydrofuran,THF
11、)和 6 种 混 合 标 准 品(PStQuickMP-M,Mw=706 000,96 400,5 970,474,370 和 266)购自日本东华株公司(TOSOH Co.,Japan)。1.2试验方法 1.2.1杜仲胶颗粒的提取纯化杜仲胶颗粒的提取参照杨正伟等(2019)和赵德刚等(1999)的方法进行。将保存在80 超低温冰箱中的新鲜叶片迅速研磨成粉末,取 100 g 放入 1 L 烧瓶中,加入提取预冷的提取缓冲液 400 mL 进行杜仲胶颗粒的提取、纯化,然后保存在30%的甘油缓冲液中,置于20 低温冰箱备用。1.2.2杜 仲 胶 颗 粒 的 显 微 观 察 取 约 0.002 g 的
12、611 月份的杜仲叶胶颗粒样品,置于干净的载玻片上,加 1 滴悬浮缓冲液,悬浮杜仲胶颗粒。盖上盖玻片并将悬浮的杜仲胶颗粒置于光学显微镜(OlympusBX43 optical microscope,OM,Japan,1 000)下观察其形态。同时,利用该显微镜标准内置测量系统测定各月样品的杜仲胶颗粒粒径并分类统计。杜仲胶颗粒的提取物每月样本设 3 个生物学重复,在显微视场内选择 5 个区域(5 cm 4.5 cm)进行粒径大小统计,即每月统计 300400 个杜仲胶颗粒。参照 Singh 等(2003)的方法,利用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM
13、)测定各月杜仲胶颗粒的形状和直径。1.2.3杜 仲 胶 颗 粒 中 的 脂 肪 酸 含 量 测 定 参 考Kittigowittana 等(2013)的方法和食品中脂肪酸外标法测定(中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会等,2016)提取杜仲颗粒中的脂肪酸,取80100 mg 纯化后的杜仲胶颗粒常规样品,置于 15 mL离心管中,加入100 L 十九酸甲酯作为内标。按如下的优化温度程序进行:初始柱温 80,保持 1 min,程序设定以10 min1 的速率升至 200,然后以5 min1 的速率升至 250;然后以 2 min1的速率升至最终温度 270 并保持 3 min;注射器和检测器温度
14、为 290;氦气作为载气,流速为 1.2 mLmin1,分流比为 301。样品中脂肪酸含量按式(1)计算:Xi=AsiCstdiFiAstdim。(1)式中,Xi代表样品中每种脂肪酸的含量 g(100 g)-1;Asi代表测定液体中脂肪酸的峰面积;Cstdi代表在标准测定液的制备中吸取的脂肪酸甘油三酯标准工作液中所含有的标准品的质量(mg);Fi代表各脂肪酸甘油三酯转化为脂肪酸的换算系数;Astdi代表标准测定液中各脂肪酸的峰面积;m 表示试样的称量质量(mg)。取该式在可重复条件下获得的 3 次独立测量值的算术平均值,并保留 3 位有效数字。1.2.4杜仲胶分子量(Mw)及分子量分布(MWD
15、)分析将每组叶片样品的杜仲胶颗粒分别用 THF 溶解至浓度 1.0 mgmL1,在 50 水浴锅中孵育 12 h以 使 其 完 全 溶 解,然 后用 0.22 m 聚 四 氟 乙 烯(polytetrafluoroethylene,PTFE)膜过滤。用凝胶渗透色谱法,即 EcoSEC 系统(EcoSEC system,TOSOH,Japan)配备控制器(HLC-8320GPC)柱温箱(1060)以及钨光检测器(范围为 1.001.80 RI),测量杜仲胶的 Mw和 MWD。GPC 采用半微量 SEC 柱(TSK-GEL SuperMultipore HZ series),制备 PStQuick
16、 聚苯乙烯标准试剂盒作为最小误差的标准样品。取 20 L 样品,将其通过 TSK 色谱柱(4.6 mm 150 mm,粒径 3 m),使色谱柱柱温箱保持在 40,流动相为 THF,流速为0.35 mLmin1,最后利用 EcoSEC-WS 工作站获得 Mw和 MWD。1.3统计分析所有结果均基于 3 次独立试验,表示为平均值(mean)标准差(SD)。用方差分析程序进行方差分析,用 SPSS Statistics 18.0 统计软件进行 T 检验,确定显著差异性(P0.05)。2结果与分析 2.1叶片胶颗粒的形态特征变化各月叶片的胶颗粒呈球形或椭圆形,形状略有不同(图 1)。总的来说,胶颗粒的
17、粒径大小随月份增加而增大,但在 9 月份以后渐趋稳定(图 2)。平均粒径6 月份为 3.99 m,11 月份升为 6.07 m,后者显著大于前者(表 1)。为进一步研究叶片胶颗粒的粒径变化规律,分别将粒径5 m 的胶颗粒区分为小颗粒和大颗粒。研究表明,小胶颗粒的粒径从 6 月的 3.22 m 显著增加到至 11 月的 3.87 m,而大胶颗粒的粒径也从5.50 m 显著增加到 6.58 m(表 2)。另外,小胶颗粒的数量比例从 6 月的 65.91%降到 11 月的 19.09%,而大胶颗粒比例从 34.09%升到 80.91%(表 2)。2.2杜仲胶颗粒中的脂肪酸组成由表 3 可 知,用 气
18、 相 色 谱-质 谱 联 用 仪(gaschromatography-mass spectrometer,GC-MS)监测到的各第 4 期刘萍等:杜仲叶胶颗粒形态、脂肪酸组成及胶分子量季节变化59 月的叶片胶颗粒脂肪酸数量在 8、10、11 月分别为 26、30 和 26 种。其中,饱和脂肪酸的种类相同,共 15 种。在这 3 个月中,饱和脂肪酸的平均含量占比为 61.35%、88.36%、79.32%,而不饱和脂肪酸的平均含量占比为38.65%、11.64%、20.68%(表 4)。以上结果表明,随着胶颗粒发育成熟,其饱和脂肪酸占比逐渐增加,不饱和脂肪酸占比则逐渐下降。在检测的饱和脂肪酸中,
19、以棕榈酸(C16:0)、二十四碳酸(C24:0)、二十二碳酸(C22:0)、花生酸(C20:0)、硬 脂 酸(C18:0)、二 十 三 碳 酸(C23:0)、肉 豆 蔻 酸(C14:0)、十七碳酸(C17:0)、二十一碳酸(C21:0)含量较高。10 月份检测到 15 种不饱和脂肪酸,以顺式油酸(C18:1n9c)、亚油酸(C18:2n6c)、顺-8,11,14-二十碳三烯酸(C20:3n6)含量较高,无反式脂肪酸;而 8 月和 11 月份共检测到 11 种不饱和脂肪酸,以顺式结构的 油 酸(C18:1n9c)、亚 油 酸(C18:2n6c)、-亚 麻 酸(C18:3n3)、顺-11,14,1
20、7-二十碳三烯酸(C20:3n3)含 表 1各月叶片胶颗粒的平均直径比较 Tab.1Comparison of mean diameters of rubberparticles from leaves in different monthsm6月June7月July8月August9月September10月October11月November3.991.33c 4.761.43b 5.081.56b 6.181.52a 6.101.53a 6.071.38an=350。数据为平均值标准差。不同字母代表差异显著(P0.05)。The sample size is 350.Data are m
21、ean SD.Different lettersindicate significant differences(P0.05).20 m20 m20 m20 m20 m20 mA6 月9 月7 月10 月8 月11 月DBECF图 1光学显微镜下各月叶片的杜仲胶颗粒形态(1 000)Fig.1Optical microscope observation under 1 000 times of Eucommia ulmoides rubber particles from leaves in different months 10 m10 m10 m10 m10 m10 mA6 月B7 月CD
22、EF8 月9 月10 月11 月图 2扫描电子显微镜下不同月份叶片杜仲胶颗粒的形态观察Fig.2SEM observation under 5 000 times of E.ulmoides rubber particles from leaves in different months60林业科学59 卷 表 2不同月份叶片胶颗粒的平均直径和比例Tab.2Average diameter and proportion of leaves rubber particles in different months月份Month小胶颗粒Small rubber particles大胶颗粒Large
23、 rubber particles平均直径Average diameter/m数量比例Proportion(%)平均直径Average diameter/m数量比例Proportion(%)63.220.75c65.915.500.83d34.0973.540.59b46.415.811.05cd53.5983.850.56ab39.366.051.19bc60.6493.810.31ab10.776.461.36a89.23103.820.27ab11.536.391.37ab88.47113.870.51a19.096.581.64a80.91SRPs:小胶颗粒(small rubber
24、particles,d 5 m).LRPs:大胶颗粒(large rubber particles(d 5 m).表 3不同月份杜仲叶胶颗粒脂肪酸甲酯组成分析Tab.3Fatty acid composition of E.ulmoides leaves rubber particles in different months序号No.脂肪酸组成Fatty acid composition不同月份脂肪酸含量Fatty acid content in different months/g(100 g)18月August10月October11月November1辛酸甲酯Octanoic acid
25、 methyl ester(C8:0)0.001 10.000 10.002 00.000 20.001 20.000 22葵酸甲酯Decanoic acid methyl ester(C10:0)0.001 00.000 10.002 70.000 30.002 40.000 23十一碳酸甲酯Eleven carbonic acid methyl ester(C11:0)0.010 70.000 40.002 20.000 70.003 00.000 24月桂酸甲酯Lauric acid methyl ester(C12:0)0.007 90.000 20.013 90.002 30.016
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