基于miR-34a-5p_...负荷心肌肥厚大鼠的保护机制_蒋碧辉.pdf
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1、内蒙古医科大学学报2023 年 4 月第 45 卷第 2 期基于miR-34a-5p/Notch1信号通路探讨蒙药四味土木香散对压力超负荷心肌肥厚大鼠的保护机制(内蒙古医科大学 基础医学院,内蒙古呼和浩特010059)【摘要】目的 探讨四味土木香散(STP)对压力超负荷性心肌肥厚大鼠的保护作用及机制。方法 第一部分:将Wistar大鼠按随机数表法分为假手术(sham)组,模型(Mod)组,Mod+STP高、中、低剂量(STP-H、STP-M、STP-L)组,Mod+阳性药卡托普利(CAP)组,检测血压、超声心动图、HE及Masson染色。第二部分:将Wistar大鼠按随机数表法分为sham组、
2、Mod组、Mod+STP-H组、Mod+STP-H+miR-34a-5p激动剂(agomir)组、Mod+STP-H+Notch1抑制剂(DAPT)组,观察HE及Masson染色,RT-qPCR检测肿瘤坏死因子(TNF-)、白介素-6(IL-6)、核因子B(NF-B)、miR-34a-5p表达量,Western Blot检测Notch1、NICD1、hes1蛋白表达量。结果 第一部分:STP各剂量组均对压力超负荷心肌肥厚具有改善作用,其中高剂量治疗效果最佳。与Mod组比,STP-H组在8周、10周时血压降低,心功能提高,细胞短轴直径及心肌纤维化降低,差异均有统计学意义(P0.05)。第二部分:
3、与Mod组比,STP-H组 TNF-、IL-6、NF-B、miR-34a-5p表达水平降低,Notch1、NICDI、hes1表达量升高,差异均有统计学意义(P0.05)。与STP-H组相比,agomir组、DAPT组细胞短轴直径及心肌纤维化增加,TNF-、IL-6、NF-B、miR-34a-5p表达水平升高,Notch1、NICDI、hes1表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 STP可抑制miR-34a-5p的表达,同时靶向激活Notch1通路而改善压力超负荷性心肌肥厚,发挥心肌保护作用。【关键词】四味土木香散;心肌肥厚;miR-34a-5p/Notch1信号通路中图分类号:R
4、917文献标识码:B文章编号:2095-512X(2023)02-0129-06蒋碧辉,魏明慧,鲁子瑜,李健英,卢孔秦,张欣,范晓梅,薛明明*收稿日期:2022-12-08;修回日期:2023-02-28基金项目:内蒙古自治区科技计划基金项目(2020GG0238);内蒙古自治区自然科学基金项目(2020MS08139,2019MS03010)第一作者:蒋碧辉(1997),女,2020级在读硕士研究生。E-mail:*通信作者:薛明明,女,医学博士,教授,博士研究生导师。研究方向:心血管生理学。E-mail:happybird-心肌肥厚(cardiac hypertrophy,CH)是心血管疾
5、病中常见的形态学改变,表现为心肌细胞体积增大、心脏质量增加,以致心室重构1。持续的CH最终会导致心力衰竭和死亡2,3。研究报道,miR-34a-5p被证明可以诱导心肌细胞凋亡4,促进心肌纤维化5,6。Notch1作为机械压力感受蛋白参与了CH的发展,同时是miR-34a-5p的直接靶基因,miR-34a-5p负调控Notch1转录7。CH的发生伴有炎症及不同程度炎症细胞的浸润8。蒙药四味土木香散(mongolian medicine siwei tu-muxiang powder,STP)具有抗炎、镇痛、抗菌等活性,其抗炎作用较优9。然而,STP对压力超负荷性CH的影响笔者暂未见文献报道。本研
6、究通过腹主动脉缩窄术(AAC)建立压力超负荷CH大鼠模型,基于miR-34a-5p/Notch1通路探究STP对不同病理阶段压力超负荷性CH大鼠的作用及其机制。现报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠169只,体质量(20020)g,购自内蒙古医科大学实验动物中心,许可证号:SYXK(蒙)2020-0003。1.1.2实验药物 四味土木香散(内蒙古蒙药股份有限公司,批号:Z20206382);卡托普利片(上海旭东海普药业有限公司,批号:H31020564)。1.1.3主要试剂与仪器HE、Masson 染色试剂盒(Solarbio,货号:G1120、G1
7、340);SDS-PAGE凝胶试剂盒(Solarbio,货号:P1200);TransScript miRNAFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物,货号:AT351-01);PerfectStart Green qPCR Su-perMix(北京全式金生物,货号:AQ601-01);Notch1(武汉三鹰生物有限公司,货号:20687-1-AP);NICD1(Affinity,货号:AF5307);hes1(博奥森生物技术有限公司,货号:bs-23073R);Gapdh(塞维尔生物,货号:GB15002);HRP-Goat Anti-Rabb
8、it mAb#1198(武汉三鹰生物有限公司,货号:SA00001-2);300A无创尾动脉血压仪(四川成都泰盟科技有限公司);超声心动图检测仪(西门子ACUSON SC 2000);PCR仪(杭州博日科技有限公司)。129DOI:10.16343/ki.issn.2095-512x.2023.02.004Journal of Inner Mongolia Medical UniversityApr.2023Vol.45No.21.2方法1.2.1实验分组 第一部分:将144只大鼠按随机数表法分为sham组、Mod组、Mod+STP-H组、Mod+STP-M组、Mod+STP-L组、Mod+C
9、AP组,每组8只,干预4周、8周、10周。第二部分:将25只大鼠按随机数表法分为sham组、Mod组、Mod+STP-H组、Mod+STP-H+miR-34a-5p 激动剂(agomir)组、Mod+STP-H+Notch1抑制剂(DAPT)组,每组5只,干预8周。1.2.2模型制备 采用腹主动脉缩窄术(AAC法)10制备压力超负荷CH大鼠模型。大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射麻醉,固定、备皮、消毒、分层开腹,暴露腹主动脉。分离腹主动脉,沿其长轴放置一根直径为0.7 mm的针头,用无菌4号手术线结扎腹主动脉和针头,拔出针头。检查腹腔清洁后,逐层缝合肌肉层和皮层,喷硫酸庆大
10、霉素溶液。术后肌肉注射10万单位青霉素钠,连续5 d。Sham组大鼠仅将4号手术线悬挂于腹主动脉上,无狭窄,其他操作与Mod组制备过程相同。1.2.3药物制备与干预第一部分:按大鼠与人的等效剂量换算方法换算。各药物组灌胃浓度为:STP-H 1.6 g/kg、STP-M 0.8 g/kg、STP-L 0.4 g/kg、CAP 0.02 g/kg。药物溶解方法:STP 20 g加纯水熬煮定容至125 mL、250 mL、375 mL,依次为高、中、低浓度;CAP20mg加入10mL生理盐水溶解。Sham组、Mod组予0.9%生理盐水灌胃,各组灌胃剂量为1mL/100g/d,灌胃4周、8周、10周。
11、第二部分:agomir组以5 mL/kg尾静脉注射用生理盐水配制成浓度为20 mol/L的miR-34a-5p激动剂,每周 2 次;DAPT 组腹腔注射浓度为 10 mg/kg 的 DAPT,隔天注射 1 次,持续 8周。1.2.4尾动脉压测量 采用全自动BP-300A无创尾动脉压测量系统进行测量。1.2.5超声心动图检测 由二维超声引导M型曲线进行经胸超声心动图测量,计算左室射血分数(EF%)和短轴缩短率(FS%)。1.2.6左心室质量指数测定左心室质量指数(LVMI)=左室重量(mg)/大鼠体质量(g)。1.2.7HE和Masson染色心脏组织固定、流水冲洗、脱水、透明,石蜡包埋,连续切片
12、(厚度为4 m),切片按照染色试剂盒依次操作。1.2.8RT-qPCR提取大鼠心肌组织总RNA,测量总RNA浓度,调整总RNA至适当浓度,用逆转录反应试剂盒进行逆转录。RT-qPCR引物由上海生工生物公司设计与合成(见表1)。1.2.9Western Blot 将心脏组织在裂解液中匀浆,在4 以12 000 g离心5 min,收集上清液,BCA法测定蛋白浓度。将等量的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离,电转移到NC膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h后将膜在4 下分别与下列抗体:Notch1(1 1 000)、NICD1(1 1 000)、hes1(1 1 000)、GAPDH(1 2 000)孵育
13、过夜。洗膜后与二抗室温孵育1 h。使用增强化学发光试剂盒及Quan-tity one软件对蛋白条带的强度进行量化。1.3统计学方法使用SPSS 22.0进行统计学分析,数据以(xs)表示,多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用独立样本t检验,检验水准为=0.05,以P 0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1第一部分2.1.1STP对各组大鼠尾动脉血压的影响 与Sham组相比,Mod组4周、8周时收缩压显著升高,差异有统计学意义(P0.05),10周时收缩压和舒张压显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与 Mod 组比,STP-H、CAP组8周、10周时血压显著降低,差异有统计
14、学意义(P0.05);STP-M、STP-L组10周时血压显著降低,差异有统计学意义(P0.01)。与CAP组比,STP-H组血压差异无统计学意义(P0.01),STP-M、STP-L组4周、10周时差异有统计学意义(P0.05)(见表2)。基因名称NK-BTNF-IL-6GAPDHmiR-34a-5pU6引物序列Forward5-GCTGTCATTGCCATCTTCTAC-3Reverse 5-GGTCTCAAACTGCTCTGAAG-3Forward5-AGGACACCATGAGCACGGAA-3Reverse 5-GGGCCATGGAACTGATGAGA-3Forward5-CCGGGA
15、GAGGAGACTTCACAG-3Reverse 5-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3Forward5-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3Reverse 5-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3Forward5-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3Reverse 通用下游引物Forward5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3Reverse 通用下游引物表1用于实时荧光定量PCR的引物序列 130内蒙古医科大学学报2023 年 4 月第 45 卷第 2 期2.1.2STP对各组大鼠心功能的影响 与Sham组相比,Mod组在8周、10周时FS%、EF
16、%显著降低,差异有统计学意义(P0.05);与Mod组相比,STP-H、CAP组在8、10周时FS%、EF%显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。STP-M组在8周时FS%、EF%显著升高,差异有统计学意义(P0.05)(见图1)。2.1.3STP对各组大鼠LVMI的影响 与Sham组相比,Mod组在8周、10周时LVMI显著升高,差异有统计学意义(P0.05);与Mod组比,STP-H、CAP组在8、10周时LVMI显著下降,差异有统计学意义(P0.05),STP-M组在10周时LVMI显著下降,差异有统计学意义(P0.05)(见图2)。2.1.4STP对各组大鼠细胞肥大的影响 3个时间
17、点的 Sham 组心肌纤维正常,心肌细胞排列规则。Mod组在4周时心肌纤维有所增宽,心肌细胞排列紊乱;在8周时心肌细胞肥大明显,间隙增宽,出现炎性细胞浸润及局灶性缺血区;在10周时心肌细胞肥大、缺血、炎性细胞浸润更加明显。3个时间点的STP-H、CAP组均有不同程度的心肌细胞肥大减轻、排列规整、炎性细胞浸润减少;STP-M组心肌纤维间隙有减小;STP-L组心肌纤维间隙稍大。细胞短轴直径统计结果显示,与Mod 组比,3个时间点内STP-H、CAP组细胞短轴直径显著降低,差异有统计学意义(P0.05);STP-M、STP-L组在8周、10周时降低,差异有统计学意义(P0.05)(见图3)。2.1.
18、5STP对各组大鼠心肌纤维化的影响3 个 时间点Sham组胶原纤维正常,无增生增粗现象。Mod组随着时间的延长,胶原纤维呈局灶性增生,且面积越来越大。这可能是因为增多的心肌细胞坏死区域使胶原纤维增生来填充坏死组织。3个时间点的STP-H、STP-M、CAP组均有不同程度的心肌纤维化改善;STP-L组心肌纤维化改善不明显。胶原体积百分比统计结果显示,与Mod组比,3个时间点内STP-H、STP-M、CAP组无冠状动脉小血管视野胶原组别Sham组Mod组STP-H组STP-M组STP-L组CAP组4周收缩压104.157.18139.7223.55*108.755.98112.9410.43117
19、.729.3392.809.19+舒张压86.309.59105.8526.9287.918.6788.8712.6983.6913.8278.698.618周收缩压102.959.58123.7011.47*104.274.84+116.0516.39118.8715.4397.496.77+舒张压87.7911.34102.686.4088.394.91+96.0114.2094.5918.4983.603.30+10周收缩压104.3317.06142.4910.69*100.208.50+106.574.52+124.1414.13+89.248.71+舒张压88.5717.76111
20、.6810.34*78.2711.08+81.226.35+88.7813.59+69.745.85+表2各组大鼠动脉血压比较(n=8)(xs,mmHg)注:与Sham组比较*P0.05,*P0.05;与Mod组比较+P0.05,+P0.05;与CAP组比较P0.05,P0.05。图1不同时间段各组大鼠FS%、EF%结果比较(n=8,xs)注:与Sham组比较*P0.05;与Mod组比较+P0.05,+P0.05。图2不同时间段各组大鼠LVMI结果比较(n=8,xs)注:与Sham组比较*P0.05;与Mod组比较+P0.05。图3各组大鼠心肌组织HE染色(50 m)及细胞短轴直径比较(n=8
21、,xs)注:A:Sham组、B:Mod组、C:STP-H组、D:STP-M组、E:STP-L组、F:CAP组与Sham组比较*P0.01;与Mod组比较+P0.05,+P0.01。4周10周8周 131Journal of Inner Mongolia Medical UniversityApr.2023Vol.45No.2体积百分比(CVF-NV)和左室总胶原体积百分比(CVF-T)显著降低,差异有统计学意义(P0.05)(见图4)。2.2第二部分2.2.1STP 介导 miR-34a-5p/Notch1 通路对各组大鼠细胞肥大的影响 由图5可见,Mod组心肌细胞肥大明显,间隙增宽;STP-
22、H 组心肌细胞稍肥大;agomir 组及 DAPT 组心肌细胞肥大明显,排列紊乱。细胞短轴直径统计结果显示,与 Mod 组比,STP-H组细胞短轴直径显著降低,差异有统计学意义(P0.05);agomir组、DAPT组较STP-H组直径均增加,差异有统计学意义(P0.05)。2.2.2STP介导miR-34a-5p/Notch1通路对各组大鼠心肌纤维化的影响 Mod组胶原纤维增生明显,心肌损伤严重;STP-H组稍有胶原增生;agomir组及DAPT组胶原纤维增生较为明显,主要集中在血管周边。胶原体积百分比统计结果显示,与Mod组相比,STP-H 组 CVF-NV、CVF-T 显著减少,差异有统
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