广东地区H9N2亚型禽流感...A和NA基因生物学特征分析_曾庆航.pdf
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1、收稿日期:2023-03-03基金项目:国家重点研发计划(2022YFD1801000);“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目(2022SDZG02);广东省基础与应用基础研究基金(2022A1515110737);云南省廖明专家工作站项目(202105AF150077)作者简介:曾庆航(1996)男,在读硕士生,研究方向为 H9N2 亚型禽流感防控,E-mail:通信作者:廖明(1968),男,博士,教授,研究方向为禽流感等家禽重大疾病防控,E-mail:广东农业科学 2023,50(5):103-111Guangdong Agricultural Sciences DO
2、I:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.05.012曾庆航,刘杨,孙敏华,胡鑫宇,谢梓民,张敏霞,袁朝霞,廖明.广东地区 H9N2 亚型禽流感病毒 HA 和 NA 基因生物学特征分析J.广东农业科学,2023,50(5):103-111.广东地区 H9N2 亚型禽流感病毒 HA 和 NA基因生物学特征分析曾庆航1,2,刘 杨2,孙敏华2,胡鑫宇2,谢梓民2,张敏霞2,袁朝霞1,廖 明2(1.仲恺农业工程学院动物科技学院,广东 广州 510225;2.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室,广东 广
3、州 510640)摘 要:【目的】监测广东地区H9N2亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)的遗传变异和分子进化趋势,为我国 H9N2 亚型 AIV 的防控提供参考。【方法】对 2022 年广东地区 3 株 H9N2 亚型 AIV 的 HA 和 NA 基因进行扩增、克隆、测序,使用DNAStar、PhyloSuite 软件进行序列拼接和比对,再运用MEGA、Megalign、NetNGlyc 1.0 Server 等软件,对其核苷酸和氨基酸序列进行遗传进化、核苷酸同源性分析,以及受体结合、蛋白活性、耐药性和糖基化等关键位点分析。【结果】系统发育树和核苷酸同源性分析
4、结果显示,3 株分离株的 HA 和 NA 基因分别属于 h9.4.2.5 分支和 1 分支,与早期毒株的核苷酸同源性分别为 81.6%91.7%和 88.2%91.2%,分别命名为 h9.4.2.5c 分支和 1.2 分支;核苷酸和氨基酸序列分析发现,HA 裂解位点为 PSRSSR GLF,受体结合位点产生 I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变,糖基化位点产生 218N 非糖基化和新增 313N 糖基化突变;NA 茎部缺失 187195 位 9 个核苷酸(ACAGAGATA),导致缺失 6365 位 3 个氨基酸(TEI);NA 红细胞结合位点产生
5、K/E/S368N、D369N 突变,与 NA 蛋白活性,耐药性的相关位点 E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 均未发生突变。【结论】2022 年广东地区分离的 3 株 H9N2 亚型 AIV 已经进化成新的亚群,部分突变可能增强了对哺乳动物的适应性,且其抗原性发生改变,但尚未获得对奥司他韦和扎那米韦等抗流感病毒药物的耐药性。关键词:H9N2;禽流感;HA 基因;NA 基因;遗传进化;生物学特征中图分类号:S858.325.3 文献标志码:A 文章编号:1004-874X(2023)05-0103-09 Biological Characteristic of
6、 HA and NA Genes of H9N2 Avian Influenza Virus in Guangdong ProvinceZENG Qinghang1,2,LIU Yang2,SUN Minhua2,HU Xinyu2,XIE Zimin2,ZHANG Minxia2,YUAN Zhaoxia1,LIAO Ming2(1.College of Animal Science&Technology,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China;2.Institute of Anima
7、l Health,Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province/Key Laboratory for Prevention and Control of Avian Influenza and Other Major Poultry Diseases,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Guangzhou 510640,China)104【研究意义】H9N2 亚型禽流感病
8、毒(Avian Influenza Virus,AIV)是目前家禽养殖中最常见的病毒之一,极易发生基因突变和基因重组,导致免疫逃逸而造成免疫失败。该病毒感染性强,传播速度快,易感染雏鸡和青年鸡群,主要侵害机体上呼吸道,可引起机体的免疫抑制,引发混合感染或继发感染,导致鸡群生长缓慢、蛋品质和产蛋量下降。由于其致病性低,导致 H9N2 亚型 AIV 在许多国家未被良好监测和有效控制,现已在全球家禽中流行;其流行广泛,危害持久,难以清除,给养禽业构成严重威胁并造成了巨大经济损失。因此,研究 H9N2 亚型 AIV 的遗传进化和生物学特征,为我国 H9N2 亚型 AIV 防控提供参考数据具有重要意义。
9、【前人研究进展】H9N2 亚型 AIV 最早于 1966 年在美国威斯康星州北部的火鸡上发现,我国则于 1992 年在广东省的鸡群中首次发现该病毒,随后该病毒在我国多地出现并蔓延,经历了 BJ94-like F98-like Y280-like 的演化,当前国内流行毒株均属于h9.4.2.5 分支(Y280-like)1-3。自 1999 年首次发现人感染 H9N2 亚型 AIV 以来,截至 2022 年 3月 30 日全球共发现 110 例,我国发生 97 例(占比 88.18%),主要集中在我国南方,而广东省报道最多4-7。据多项研究报道,H9N2 已取代H5N6 和 H7N9 成为在禽类
10、中流行的优势亚型,且其作为病毒基因库为 H3N8、H5N1、H5N6、H7N9、H10N8 等亚型 AIV 提供内部基因进行基因重组,被认为可能引起下一次流感大流行8-15。【本研究切入点】AIV 属于正黏病毒科甲型流感病毒属,基因组由 8 个长度在 8902 341 个核苷酸的单链负义 RNA 片段组成,可编码病毒的17 种结构蛋白,其中以 HA 和 NA 变异最大,是AIV 最主要的保护性抗原,因此 HA 和 NA 基因常作为基因变异依据用于 AIV 遗传进化和生物学特征分析16。【拟解决的关键问题】本研究通过对 2022 年广东地区 3 株 H9N2 亚型 AIV 的 HA和 NA 基因
11、进行遗传进化和生物学特征分析,为我国 H9N2 亚型 AIV 的进化分析和防控提供参考。1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 供试毒株 H9N2 亚型 AIV 毒株 A/Chicken/Guangdong/JY01/2022、A/Chicken/Guangdong/FS03/2022、A/Chicken/Guangdong/KP03/2022(表 1),由广东省农业科学院动物卫生研究所分离鉴定和纯化保存。1.1.2 引物 设计合成 AIV-12bp 随机引物、HA和 NA 基因 PCR 通用引物(表 2),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.1.3 主要试剂 病毒 DNA/R
12、NA 提取试剂盒Abstract:【Objection】This study aimed to monitor the genetic variation and molecular evolutionary trends of H9N2 avian influenza virus(AIV)in Guangdong,and provide reference data for the evolutionary analysis and prevention and control of H9N2 AIV in China.【Method】The HA and NA genes of three
13、 H9N2 AIV strains isolated from Guangdong in 2022 were amplified,cloned,and sequenced.The DNAStar and PhyloSuite software were used for sequence assembly and alignment.The MEGA,Megalign,NetNGlyc 1.0 Server,and other software were used for genetic evolution,percent identity,receptor binding,protein a
14、ctivity,drug resistance,and glycosylation site analysis of their nucleotide and amino acid sequences.【Result】The phylogenetic tree showed that the HA gene of the three isolates belonged to the clade h9.4.2.5 and the NA gene belonged to the clade 1.However,the nucleotide homology with the early strai
15、n was only 81.6%91.7%and 88.2%91.2%,formed new clade named clade h9.4.2.5c and clade 1.2,respectively.The nucleotide and amino acid sequence analysis revealed that the HA cleavage site was PSRSSR GLF.The receptor binding site underwent I155T,H183N,A190T/V,T212I,Q226L,and Q227M mutations.The glycosyl
16、ation site underwent 218N non-glycosylation and acquired new glycosylation site at 313N.The NA stalk showed nine nucleotides deletion at positions 187-195(ACAGAGATA),leading to the loss of three amino acids at positions 63-65(TEI).The absorbtion site of NA on red blood cells showed K/E/S368N and D36
17、9N mutations.No related mutations to neuraminidase activity and drug resistance were found at the E119,D151,R152,R224,E276,R292,and R371.【Conclusion】The HA and NA genes of the three H9N2 AIV isolated from Guangdong in 2022 had evolved into a new subgroup.Some mutaitons suggest that prevalent H9N2 in
18、 Guangdong may enhanc adaptability of mammals and its antigenicity has changed.Moreover,it has not yet acquired resistance to durgs oseltamivir and zanamivir.Key words:H9N2;avian influenza;HA gene;NA gene;genetic evolution;biological characteristic105(磁珠法)购自西安天隆科技有限公司,2Taq Master Mix 和 DL2000 DNA Ma
19、rker 购 自 南 京 诺唯赞生物科技股份有限公司,PrimeScript RT Master Mix、pMD19-T 载体和 DH5 感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司,琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒和质粒提取纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。表 2 引物信息Table2 Primer information引物名称Primer name目的产物长度Expected product length(bp)退火温度Annealing temperature()引物序列Primer sequence(5-3)AIV-12bpAGCAAAAGCAGGHA-F1683 54 TAT T
20、CG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGGGHA-RATA TCG TCT CG T AT TAGTAGAAA CAA GGG TGT TTTNA-F141054 TAT TGG TCT CAG GG AGC AAA AGC AGG AGTNA-RATA TGG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT表 1 毒株信息Table1 Virus strains information毒株Strain宿主Host采样地点Sampling location采样时间Sampling timeA/Chicken/Guangdong/JY01/202
21、2鸡广东揭阳2022 年 1 月A/Chicken/Guangdong/FS03/2022鸡广东佛山2022 年 3 月A/Chicken/Guangdong/KP03/2022鸡广东开平2022 年 3 月1.2 试验方法1.2.1 HA 和 NA 基因扩增、克隆及测序 对病毒液进行总 RNA 提取,根据 PrimeScript RT Master Mix 说明书,使用 AIV-12bp 随机引物进行反转录获得 cDNA;使用 HA 和 NA 基因通用引物进行PCR 扩增,将目的基因纯化回收,与 pMD19-T 载体连接并转入 DH5 感受态细胞,挑取阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有
22、限公司进行 Sanger 测序。1.2.2 HA 和 NA 基因遗传进化及氨基酸关键位点分析 采用 SeqMan、Editseq、PhyloSuite 软件对核苷酸序列进行拼接,并进行氨基酸关键位点比对分析;运用 Megalign 软件对核苷酸序列进行同源性分析;利用 MEGA11 软件采用 ML 法绘制 HA、NA 基因遗传进化树;使用 NetNGlyc 1.0 Server软件对氨基酸序列N-糖基化位点进行分析。2 结果与分析2.1 HA 和 NA 基因 PCR 扩增和测序结果3 株 H9N2 亚 型 AIV 的 HA 和 NA 基 因 PCR扩增产物分别在1 683 bp和1 401 b
23、p的位置(图1)。测序结果与预期大小一致,3 株病毒的 HA 基因完整开放阅读框(ORF)各含有 1 683 个核苷酸,NA 基因完整 ORF 各含有 1 401 个核苷酸(图 2)。M:DL2000 Marker;P:阳性对照;N:阴性对照;J、K、F:PCR 产物M:DL-2 000 Marker;N:Negative control;P:Positive control;J,K,F:PCR product 图 1 HA(A)、NA(B)基因的 PCR 产物Fig.1 PCR p roducts of HA(A)and NA(B)genes106图 2 3 株 H9N2 亚型 AIV 的
24、HA、NA 基因 ORF 测序结果Fig.2 ORF sequencing results of HA and NA genes of three H9N2 AIV strains2.2 HA 和 NA 基因系统发育树分析结果基因系统发育树分析结果显示,HA 基因属于当前国内流行的 h9.4.2.5 分支,与经典株 A/Chicken/Guangxi/55/200 的遗传距离较远,已进化成新的亚群,命名为 h9.4.2.5c 分支(图 3A);NA 基因仍属于 1 分支,与早期流行的经典株 A/Duck/Hong Kong/Y280/97 遗传距离较远,在近几年形成了一个相对稳定的新的亚分支,
25、命名为 1.2分支(图 3B)。2.3 HA 和 NA 基因核苷酸 序列同源性分析结果核苷酸序列比对分析结果(表 3)显示,3 株 H9N2 亚型 AIV 之间 HA 基因核苷酸序列同源107表 3 HA 和 NA 基因核苷酸序列同源性Table 3 Homology of nucleotide sequence of HA and NA gene(%)分支Clade毒株StrainHA 基因HA geneNA 基因NA geneh9.4.2.1A/Chicken/Beijing/1/94(经典株)86.386.888.288.5h9.4.2.2A/Chicken/Shanghai/F/98(
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