DB65∕T4640-2022 胡杨雌雄株分子鉴定技术规程(新疆维吾尔自治区).pdf
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1、ICS 65.020.01CCS B 60B65新 疆维吾 尔自治 区地方 标 准DB 65/T 46402022胡杨雌雄株分子鉴定技术规程Technical code of practice for molecular identification of male and female Populus euphratica2023-04-20 发布2023-06-20 实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发 布DB 65/T 46402022目 次前言.II引言.Ill1范围.12规范性引用文件.13 术语和定义.14原理.15 试剂与仪器.16 检测方法.3附录A(规范性)试剂配制.4附录
2、B(规范性)胡杨叶片DNA的提取.5附录C(规范性)用于扩增胡杨雌雄共有DNA分子标记(FM)和雄株特有DNA分子标记(FF)的引物 6 附录D(规范性)扩增胡杨雌雄共有DNA分子标记(FM)和雄株特有DNA分子标记(FF)的PCR条件 7 附录E(资料性)胡杨雌雄株分子鉴定结果登记.8参 考文献.91DB 65/T 46402022前 言本文件按照G B/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由塔里木大学提出。本文件由新疆维吾尔自治区林业和草原局归口并组织实施。本文件起草单位:塔里木大学、浙江师范大学、新疆维吾尔自治区标准化研究院、新疆生
3、产建设兵 团林业和草原工作总站。本文件主要起草人:李志军、吴智华、胡小明、焦培培、张山河、葛廷进、柴政、陈向向、翟军团、韩晓莉。本文件实施应用中的疑问,请咨询塔里木大学。对本文件的修改意见建议,请反馈至新疆维吾尔自治区林业和草原局(乌鲁木齐市黑龙江路69号)、塔里木大学(阿拉尔市虹桥南路705号)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167 号)。新疆维吾尔自治区林业和草原局联系电话:0991-5813240;传真:0991-5580237;邮编:830000塔里木大学联系电话:0997-4680643;传真:0997-4680643;邮编:843300新疆维吾尔自治区市场监督管
4、理局联系电话:0991-2818750;传真:0992311250;邮编:83000411DB 65/T 46402022引 言本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到6.2、6.3和6.4中相应内容的相关专 利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下,就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得:专利持有人姓名:塔里木大学、中南民族大学。地址:新疆维吾尔自治区阿拉尔市虹桥南路705号、湖北省武汉市洪山区民族大道
5、182号。请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责 任。IIIDB 65/T 46402022胡杨雌雄株分子鉴定技术规程1范围本文件规定了胡杨QPopulus euphratica Oliv.)雌雄鉴定的PCR方法。本文件适用于任何生长阶段胡杨植株的雌雄鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。G B/T 6682分析实验室用水规格和试验方法G A/T 383法庭科学DNA实验室检验规
6、范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1雄株特有DNA分子标记male specific DNA marker通过生物信息学等方法分析获得的一段胡杨雄株特有的DNA序列片段。3.2雌雄共有 DNA 分子标记 male and female shared molecular DNA marker通过生物信息学等方法分析获得的一段胡杨雌雄共有的DNA序列片段。3.3雌雄鉴定方法sex identify利用胡杨雄株特有的DNA分子标记和雌雄共有的DNA分子标记检测胡杨雌雄的方法。4原理4.1利用PCR技术,对胡杨雄株特有DNA序列片段和雌雄共有DNA序列片段进行扩增,电泳检测PCR 扩增产物
7、,根据扩增产物电泳条带鉴定胡杨的雌雄。5试剂与仪器5.1 试剂5.1.1 纯水。水的质量要求按照G B/T 6682执行。5.1.2 Taq PCR Mix预混液(2X,含蓝染料)。5.1.3 G oldView核酸染料。DB 65/T 464020225.1.4 DNA Marker(Trans DL2000)5.1.5琼脂糖(分析纯)。5.1.6 无水乙醇(分析纯)。5.1.7 异丙醇(分析纯)。5.1.8氯仿(分析纯)。5.1.9异戊醇(分析纯)。5.1.10三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)(分析纯)。5.1.11浓盐酸(分析纯)。5.1.12 Na2EDTA 2H20(分析纯)。5.1.
8、13 NaOH(分析纯)。5.1.14 NaCl(分析纯)。5.1.15 0-疏基乙醇(分析纯)。5.1.16聚乙烯毗咯烷酮(PVPP)(分析纯)。5.1.17十六烷基三乙基浪化镀(CTAB)(分析纯)。5.1.18乙酸钠(分析纯)。5.1.19 液氮。5.1.20 1 mol/L Tris-H Cl溶液(pH=8.0)(具体制备方法应符合附录A的要求)。5.1.21 0.5 mol/L EDTA溶液(pH=8.0)(具体制备方法应符合附录A的要求)。5.1.22 氯仿/异戊醇(24:1)溶液(具体制备方法应符合附录A的要求)。5.1.23 3 mol/L乙酸钠溶液(pH=5.2)(具体制备方
9、法符合附录A的要求)。5.1.24 70%酒精溶液(具体制备方法应符合附录A的要求)。5.1.25缓冲液分为以下两种(具体制备方法应符合附录A的要求):a)1XDNA溶解缓冲液(TE)0b)50义TAE缓冲液。5.2仪器5.2.1组织研磨机。5.2.2 高速冷冻离心机。5.2.3核酸测定仪。5.2.4 PCR 仪。5.2.5纯水仪。5.2.6制冰机。5.2.7 电泳仪。5.2.8水平电泳槽及制胶附件。5.2.9凝胶成像系统。5.2.10 电子天平。5.2.11恒温水浴锅。5.2.12微量移液器。5.2.13磁力搅拌器。5.2.14 pH 计。5.2.15 高压灭菌锅。2DB 65/T 4640
10、20226检测方法6.1 DNA的提取采取胡杨叶片,从胡杨叶片中提取DNA。具体方法应符合附录B的要求。6.2 引物用于扩增胡杨雄株特有DNA分子标记(FF)和雌雄共有DNA分子标记(FM)的引物序列应符合附录C 的要求。6.3 DNA分子标记的扩增及检测用于扩增胡杨雄株特有DNA分子标记(FF)和雌雄共有DNA分子标记(FM)的PCR条件,以及PCR扩增 产物的电泳检测方法应符合附录D的要求。PCR操作中防止污染等注意事项按照G A/T 383执行。6.4 结果判定6.4.1通过凝胶电泳结果(附录D中的图D.1)进行雌雄株的判定:a)同时出现胡杨雌雄共有DNA分子标记(FM)的条带和雄株特有
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