金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性及耐药基因检测分析_李伦.pdf
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1、安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul,27(7)金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性及耐药基因检测分析李伦1,张丽娜1,王兵1,刘彩林2作者单位:1平顶山市第一人民医院检验科,河南 平顶山467000;2郑州大学第一附属医院检验科,河南 郑州450052基金项目:国家自然科学基金资助项目(82102438)摘要:目的 探讨金黄色葡萄球菌(SA)对万古霉素的耐药性及耐药基因分布情况。方法 收集平顶山市第一人民医院2020年4月至2022年3月临床送检样本分离的288株SA菌株,采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴
2、定和药敏系统以及纸片扩散法进行菌落鉴定与药敏试验;采用聚合酶链反应检测pbp4、mgrA、agr、vraS、vraR、icaA、icaR基因表达。结果 288株SA菌株中筛选出25株万古霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌(hVISA)菌株,hVISA阳性率为8.68%,未检测到万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌(VISA)菌株和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)菌株;万古霉素敏感金黄色葡萄球菌(VSSA)菌株万古霉素最小抑菌浓度(MIC)主要分布在0.50 mg/L和0.75 mg/L,占比为41.83%和28.90%;hVISA菌株万古霉素MIC主要分布在1.50 mg/L和2.00 mg/L,占
3、比为56.00%和28.00%;VSSA菌株pbp4、agr、icaR的相对表达量均低于hVISA菌株(P0.05),而mgrA、vraS、vraR、icaA的相对表达量均高于hVISA菌株(P0.05)。结论 本次调查hVISA两年总流行率为8.68%。与VSSA菌株比较,hVISA菌株pbp4、agr、icaR、mgrA、vraS、vraR、icaA基因表达存在差异,可能与万古霉素的耐药性有关。关键词:金黄色葡萄球菌;万古霉素;耐药;基因检测Resistance of Staphylococcus aureus to vancomycin and detection of resistan
4、ce genesLI Lun1,ZHANG Lina1,WANG Bing1,LIU Cailin2Author Affiliations:1Department of Laboratory,Pingdingshan First Peoples Hospital,Pingdingshan,Henan 467000,China;2Department of Laboratory,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,ChinaAbstract:Objective To invest
5、igate the drug resistance of Staphylococcus aureus(SA)to vancomycin and the distribution of drug resistance genes.Methods A total of 288 strains of SA isolated from clinical samples submitted in Pingdingshan First Peoples Hospital from April 2020 to March 2022 were collected.Vitek 2 Compact automati
6、c bacterial identification,Drug Sensitivity System and disk diffusion method were used for colony identification and drug sensitivity test.The gene expressions of pbp4,mgrA,agr,vraS,vraR,icaA and icaR were detected by polymerase chain reaction.Results Among 288 SA strains,25 vancomycin heterogeneous
7、 resistant staphylococcus aureus(hVISA)strains were screened,and the positive rate of hVISA was 8.68%.Vancomycin mediated resistance staphylococcus aureus(VISA)strains and vancomycin resistant staphylococcus aureus(VRSA)strains were not detected.Vancomycin minimum inhibitory concentration(MIC)of van
8、comycin sensitive staphylococcus aureus(VSSA)strains were mainly distributed at 0.50 mg/L and 0.75 mg/L,accounting for 41.83%and 28.90%.The vancomycin MIC of hVISA strains were mainly distributed at 1.50 mg/L and 2.00 mg/L,accounting for 56.00%and 28.00%.The relative expressions of pbp4,agr and icaR
9、 in VSSA strains were lower than those in hVISA strains(P0.05),while the relative expressions of mgrA,vraS,vraR and icaA were higher than those in hVISA strains(P0.05).Conclusion The prevalence of hVISA in SA in our hospital in recent two years is 8.68%.There are differences in the expressions of pb
10、p4,mgrA,agr,vraS,vraR,icaA and icaR genes between VSSA and hVISA strains,which may be related to the drug resistance of vancomycin.Key words:Staphylococcus aureus;Vancomycin;Drug resistance;Gene detection金黄色葡萄球菌(SA)是临床常见的致病菌,随着1961年英国首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)至今,MRSA检出率急剧上升,已成为临床抗感染治疗的一大难题1。万古霉素是治疗MRSA感
11、染最常用的药物和最后防线2,然而随着MRSA感染率上升和万古霉素的大量广泛使用,万古霉素敏感性降低的MRSA及万古霉素治疗失败不断被报道3。尽管按照美国临床实验室标准化研究协会的判读折点,MRSA对万古霉素仍处于敏感范围,但国内外均有大量研究报道万古霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌(hVISA)和万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌(VISA),且近年来其检出率呈上升趋临床医学引用本文:李伦,张丽娜,王兵,等.金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药性及耐药基因检测分析 J.安徽医药,2023,27(7):1338-1342.DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2023.07.013.133
12、8安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul,27(7)势,需引起临床高度重视4-5。目前关于SA对万古霉素的具体耐药机制尚不清楚,有研究发现菌种会通过基因调控方式来获得适应力6,也有研究发现hVISA 和 VISA 细胞壁相关代谢基因表达存在改变7。故本研究针对临床送检标本分离的SA进行万古霉素耐药性检测及基因检测分析,以期为临床合理治疗控制感染提供参考依据,详情如下。1材料与方法1.1菌株来源选取平顶山市第一人民医院2020年4月至2022年3月临床送检样本1 592例,分离出288株SA菌株(均为首次分离),检出率1
13、8.09%。SA样 本 来 源:脓 液 173 份(60.07%)、血 液 34 份(11.80%)、胸腹水 32 份(11.11%)、引流液 26 份(9.03%)、痰液23份(7.99%),去除重复菌株。1.2抗菌药物及培养基万古霉素抗菌药物、E-test实验条、血平板均购自郑州安图生物工程股份有限公司,脑心浸液琼脂基础和MH琼脂基础由英国Oxoid公司提供,脱纤维羊血购自郑州农达生物制品有限公司。1.3SA鉴定及抗菌药物敏感性检测试验 SA菌株经MH琼脂培养后挑选单个菌落,经革兰染色和触酶试验证实后用传统划线法接种于琼脂培养基上进行分离纯化,用法国生物梅里埃公司 Vitek 2 Comp
14、act全自动细菌鉴定和药敏仪器及纸片扩散法进行菌株鉴定与药物敏感性试验,SA 质控菌株为ATCC29213和ATCC25923。采用E-test法检测万古霉素最小抑菌浓度(MIC),按照美国临床实验室标准化委员会(2021年CLSI M100-S31)推荐的方法进行操作,按CLSI规定的临界值对药物敏感性试验结果进行判读。1.4hVISA 的检测方法用 0.85%氯化钠溶液将SA菌株制备成浊度为0.5麦氏的菌悬液,经胰蛋白胨大豆肉汤过夜培养后用无菌L棒将原液、110-3稀释悬液、110-6稀释悬液涂于万古霉素浓度为 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、4.0
15、 mg/L、8.0 mg/L的脑心浸液琼脂平板上,35 培养48 h,选取生长最好菌落的平板进行计数,并计算实际菌落数,实际菌落数=菌落计数相应稀释倍数。将Mu3作为阳性对照,采用Graphpad Prism8.0软件绘制菌落数对数值对万古霉素浓度的曲线,并计算曲线下面积,并与Mu3比较,结果判读:比值0.9判定为万古霉素敏感金黄色葡萄球菌(VSSA),比值0.9且1.3判定为hVISA,比值1.3判读为VISA8。1.5基因检测将SA菌株接种在血平板上,采用德国 QIAGEN 公司生产的 Puregene Yeast/Bact 试剂盒提取 RNA,采用 QuantiTect Reverse
16、Transcriptase试剂盒进行逆转录合成cDNA,严格按照试剂盒说明书进行操作;采用实时定量聚合酶链反应检测pbp4、mgrA、agr、vraS、vraR、icaA、icaR 基因的表达,以16S RNA作为内参,以2Ct表示目的基因相对表达量,其中引物序列见表1。1.6统计学方法采用SPSS 23.0统计学工具处理数据,计量资料行正态性检验和方差齐性检验,均符合正态分布且方差齐,以x s形式描述,不同菌株耐药基因相对表达量比较采用独立样本t检验;计数资料以频数、百分比形式描述,P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1MRSA检测结果及其对常用抗菌药物敏感性检测结果288 株 SA 筛
17、选出 MRSA 菌株 116 株(40.28%),甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株 172株(59.72%)。MRSA菌株和 MSSA菌株对利奈唑胺、替加环素、万古霉素均敏感,见表2。2.2hVISA 检测结果288 株 SA 共筛选出 25 株hVISA菌株,hVISA阳性率为8.68%,其余263株SA均对万古霉素敏感,未检测到VISA菌株和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)菌株。E-test法检测万古霉素MIC,结果显示VSSA菌株万古霉素MIC主要分布 在 0.50 mg/L 和 0.75 mg/L,占 比 为 41.83%和28.90%;hVISA菌株万古霉素 MIC主
18、要分布在 1.50 mg/L和2.00 mg/L,占比为56.00%和28.00%,见表3。2.3耐药基因检测结果VSSA菌株pbp4、agr、icaR基因相对表达量均明显高于hVISA(均P0.05);VSSA菌株mgrA、vraS、vraR、icaA基因相对表达量均明显低于hVISA(均P0.05),见表4。表1PCR引物序列引物名称pbp4mgrAagrvraSvraRicaAicaR16S RNA引物序列5-3正向GAGTTTGCCTGGTACAGAT反向CTTACCATTTATCCTTTGC正向TGGGATGAATCTCCTGTAAACGT反向GTTCCATTCGTTTTAATAAT
19、GGTG正向GTGCCATGGGAAATCACTCCTTCC反向TGGTACCTCAACTTCATCCATTATG正向TTTATACCATACACTCGTACC反向TTGCTGACTAACAGAATCG正向AGTTATCTATCAACGCAAAG反向TGTCTTCCATAAGTAAATCC正向CTTGCTGGCGCAGTCAATAC反向GCGTTGCTTCCAAAGACCTC正向GGAGTATGACGGTACAACAC反向CGCCTGAGGAATTATCTGGA正向CGTGCTACAATGGACAATACAAA反向ATCTACGATTACTAGCGATTCCA1339安 徽 医 药 Anhui
20、 Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul,27(7)3讨论自 20世纪 80年代起,万古霉素逐渐成为治疗MRSA引起的重度感染的一线药物,成为治疗重症SA感染的重要保障。但随着耐万古霉素的肠球菌的出现,有学者认为SA很有可能从耐万古霉素肠球菌中获得 vanA 耐药基因进而对万古霉素产生耐药9,虽然至今尚未在SA中检测到vanA耐药基因,但随着hVISA和VISA的出现,国内外陆续有关于万古霉素治疗SA的敏感性下降问题的相关报道出现。因此,检测分析 SA对万古霉素的耐药基因的意义重大。本研究对近两年来临床送检样本分离的288株SA 菌 株 进 行
21、耐 药 性 检 测,其 中 MRSA 菌 株 占40.28%,由此可见 SA对甲氧西林抗菌药物的耐药情况较为严重,分析其原因:MRSA 具有广谱耐药性,临床检出率较高可能与治疗时不规范使用抗生素有关,且MRSA以定植或接触传播,消毒隔离不到位及免疫力低下、不注重手卫生病人均易引起MRSA感染传播,需引起临床高度重视。hVISA被认为是VISA的前体,可能会进化为VISA,本研究通过药物敏感性检测发现:288株 SA 菌株检出 25株hVISA菌株,hVISA阳性率为8.68%,表明SA对万古霉素存在一定的耐药趋向。另外,本研究发现VSSA菌株万古霉素MIC主要分布在0.50 mg/L和0.75
22、 mg/L,而hVISA菌株万古霉素MIC主要分布在1.50 mg/L和2.00 mg/L,提示在万古霉素高MIC可能是发生SA耐万古霉素的征兆。近年来不断有研究发现MRSA分离株中万古霉素MIC升高,均值从1.3 mg/L增加1.5 mg/L,并与治疗失败可能相关10,故临床需高度重视。目前,有学者认为SA对万古霉素的耐药性主要是由细菌的细胞壁增厚引起的11。既往研究在VISA 菌株中发现,walk 等基因发生部分突变会导致细胞壁代谢相关基因发生改变,使细菌的细胞壁增厚,药物的敏感度被削弱12。刘明涛等13发现在大部分的hVISA菌株中出现了walk基因突变,且均为点突变,而 walk 属于
23、 walkR 二元信号系统,该系统可调控细胞壁代谢的上游基因 atlA、ssaA、isaA、lytM,使其表达下调,从而减缓细胞壁的代谢,使细胞壁的厚度明显增加,从而使细菌对万古霉素的敏感度削弱,耐药性上升。此外,SA对万古霉素的耐药性增强还与 ropB(编码 DNA 依赖的 RNA 聚合酶亚单位)、graSR(编码双组分调节系统)等多处基因位点突变相关5,14-15。本研究据此通过筛选可能参与SA发生万古霉素耐药的基因,并对比其在VSSA菌株和 hVISA 菌株中的表达差异,发现 VSSA菌株pbp4、agr、icaR的相对表达量均明显高于 hVISA菌株,而 mgrA、vraS、vraR、
24、icaA 的相对表达量均明显低于hVISA菌株,提示上述基因可能介导hVISA的转化,并可能参与SA耐万古霉素的机制。pbp4具有羧肽酶活性,参与了 SA细胞壁肽聚糖的二级交表2MRSA和MSSA对常用抗菌药物敏感性检测结果/例(%)抗菌药物苯唑西林青霉素G克林霉素庆大霉素利福平莫西沙星左旋氟氧沙星环丙沙星复方磺胺甲唑呋喃妥因利奈唑胺四环素替加环素万古霉素MRSA(n=116)耐药116(100.00)116(100.00)86(74.14)27(23.28)56(48.28)25(21.55)30(25.86)80(68.97)11(9.48)4(3.45)0(0)66(56.90)0(0)
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