基于斑马鱼模型探究多花黄精多糖的免疫调节作用_张雪.pdf
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1、基金项目:国家重点研发计划项目()作者简介:张雪(.),女,硕士研究生在读,研究方向:中药品质评价,:.通信作者:马志强(.),男,博士,研究员,研究方向:中药药效物质基础研究,:.实验研究基于斑马鱼模型探究多花黄精多糖的免疫调节作用张 雪,赵苑伶,陈林珍,刘 妍,刘 静,赵崇军,刘永刚 马志强,(北京中医药大学中药学院,北京,;中药品质评价北京市重点实验室,北京,)摘要 目的:探讨多花黄精多糖(,)及 对氯霉素所致免疫损伤的保护作用。方法:采用水提醇沉法得到黄精粗多糖,除蛋白脱色素后,得到。利用 层析柱和 凝胶柱先后对 进行洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥后得到纯化的。以受精后 ()的转
2、基因斑马鱼为实验动物,采用不同浓度的氯霉素处理,通过比较斑马鱼尾部中性粒细胞的数目,确定氯霉素的最优造模剂量,建立斑马鱼免疫抑制模型。分别加入不同浓度的 和 孵育 后,拍照统计斑马鱼泄殖腔至尾部中性粒细胞数目,观察 和 的免疫调节作用。结果:为均一多糖,分子量为 。与溶剂对照组比较,氯霉素组的中性粒细胞数目显著减少(.);与氯霉素组比较,在实验剂量范围内,和 均可以增加斑马鱼体内中性粒细胞的数目(.),且量效关系明显。结论:和 均具有一定的增强免疫活性及改善免疫损伤的作用。关键词 多花黄精;多糖;分离纯化;斑马鱼;免疫调节;中性粒细胞 ,(,;,):():,(),:,(.),(.),:;中图分
3、类号:;文献标识码:黄精为百合科植物滇黄精 .、黄精 .或多花黄精 的干燥根茎。黄精味甘、性平、无毒,归肺、脾、肾经,具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效。作为我国常用的补益类药材,也是重要的药食同源药材,黄精药用历史悠久,临床疗效确切。名医别录 中记载黄精“主补中益气,除风湿,安五脏。久服轻身、延年、不饥”,具有“仙人余粮”的美誉。黄精主要含有糖类、皂苷、黄酮、挥发油、氨基酸等多种化学成分,多糖作为黄精中的有效成分,具有调节免疫功能、抗疲劳、抗衰老等多种药理作用。目前黄精在医药、保健、食品、化妆品等行业均具有良好的市场前景,具有较大的开发潜力。世界中医药 年 月第 卷第 期氯霉素作为一种广谱
4、抗生素,是治疗伤寒的首选药,但同时也伴随着抑制骨髓造血功能的不良反应,如粒细胞数目下降。王荣春等以斑马鱼幼鱼为实验对象,发现氯霉素具有免疫毒性,可以降低其免疫细胞的数目,在 的质量浓度范围内,斑马鱼幼鱼尾部中性粒细胞的数目与空白组比较具有显著性差异。中药多糖通过多种方式对免疫系统发挥调节作用,主要表现为免疫增强或刺激作用。中药多糖可以激活免疫细胞,如活化巨噬细胞、促进淋巴细胞增殖、提高自然杀伤(,)细胞的杀伤活性等,还可以促进白细胞介素(,)及干扰素等细胞因子的分泌,激活补体系统,促进抗体产生。与其他免疫调节剂相比,中药多糖具有疗效确切、不良反应轻等优点,在医疗及保健方面有着巨大的发展前景。目
5、前学者研究发现,黄精多糖可以促进巨噬细胞的增殖,增加细胞免疫因子的分泌量。学者采用环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制模型评价黄精多糖对免疫系统的调节作用,发现黄精多糖可以促进脾脏和胸腺指数恢复及 细胞、细胞的增殖,增强腹膜巨噬细胞的吞噬功能,通过维持机体中辅助型 细胞(,)肿瘤坏死因子(,),(,)动态平衡,进而恢复机体的免疫系统。这些研究均表明黄精多糖是一种具有潜力的免疫佐剂。相较于传统的动物模型,斑马鱼具有高通量、产卵量大、实验周期短、胚胎透明易观察、基因与人类具有高度相似性、实验成本低等特点,可应用于筛选有效成分、药效及安全性评价、阐述药物代谢过程等。在免疫活性评价研究中,目前已构建了多种免疫细
6、胞荧光标记斑马鱼,如中性粒细胞、巨噬细胞等,所以可利用荧光显微镜对斑马鱼荧光细胞拍照,通过比较荧光细胞数目或者荧光强度来评价药物的免疫活性。本研究利用氯霉素诱导构建斑马鱼免疫抑制模型,以中性粒细胞数目为指标评价多花黄精多糖(,)的免疫活性,为研究黄精的免疫活性提供依据,也为 作为免疫佐剂的进一步开发及临床应用提供新的思路与理论依据。材料与方法.材料.动物 野生型 系斑马鱼和 (:)中性粒细胞转基因品系斑马鱼亲本购于国家斑马鱼资源中心,由本实验室繁殖饲养。本课题按照北京中医药大学实验动物中心动物伦理委员会的指导准则进行斑马鱼实验研究。斑马鱼饲养条件:成年斑马鱼饲养于循环水养殖系统中,雌雄斑马鱼分
7、开饲养,保持 光照黑暗交替,值 .,电导率 ,水温(.),每日投喂丰年虾 次。.药物 多花黄精饮片(购于安徽润元生物有限公司,批号:)由北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定为百合科植物多花黄精()的干燥根茎。.试剂与仪器 (北京索莱宝科技有限公司,批号:);(东 曹 生 物 科 技 有 限 公 司,日 本,批 号:);氯 霉 素(源 叶 生 物,批 号:);盐酸小檗胺(北京索莱宝科技有限公司,批号:);葡聚糖标准品、(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:、);二甲基亚砜(,)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:);硫酸(北京市通广精细化工公司,批号:);苯酚(天津市大茂化学试剂厂,批号:);活性
8、炭(苏州信清科技有限公司,批号:);氯化钠(北京化工厂,批号:)。斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技有限公司,型号:);体式荧光显微镜(公司,德国,型号:);恒温生化培养箱(广州沪瑞明仪器有限公司,型号:);数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,型号:);真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,型号:);冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司,型号:);电子分析天平(公司,瑞士,型号:);恒流泵(上海青浦沪西仪器厂,型号:);自动部分收集器(上海青浦沪西仪器厂,型号:);傅里叶变换红外光谱仪(公司,美国,型号:);移液器(公司,德国,型号:、)。.方法.的提取取适量黄精药材粉碎过五十目筛,得到
9、黄精粉末。称取适量黄精粉末,以水为提取溶剂,加入 倍体积量的水,水浴回流提取 ,重复提取 次,抽滤,合并滤液,减压浓缩至一定体积,缓慢加入 乙醇并不断搅拌,至最终含醇量达到,静置过夜,次日抽滤,沉淀用无水乙醇洗涤 次,真空干燥得到黄精粗多糖。称取黄精粗多糖粉末溶于去离子水中,加入体积比()试剂(氯仿:正丁醇 )脱蛋白,重复多次至两液面间无白色沉淀产生,减压浓缩除去有机试剂,加入适量活性炭脱色,抽滤后使用透析袋(截留分子量 )透析 除去小分子,冷冻干燥,得到。.的分离纯化 精密称取 溶于 去离子水中,过.水系滤膜后,以 的洗脱速度通过 层析柱,分别用去离子水,.、.、.、.、.、.的 溶液进行梯
10、度洗脱,利用苯酚硫酸法检测每管的多糖含量,其中去离子水洗脱部分多糖含量最高,收集含有多糖的试管,合并洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥。将冻干后的 样品再次在 凝胶柱上进行分离,用蒸馏水进行洗脱,苯酚硫酸法检测每管的多糖含量,收集洗脱液,冷冻干燥后得到纯化后的 样品,命名为,其得率为。.的纯度及相对分子量测定配置 的不同分子量葡聚糖标准品溶液及 溶液,过.微孔滤膜,采用高效凝胶渗透色谱(,)法对 进行纯度测定及相对分子量的测量,根据色谱图上的峰数目及峰形鉴定 纯度,记录 样品的出峰时间,对照葡聚糖标准品的出峰时间计算出的标准曲线,计算 的分子量。色谱条件:高效液相色谱。检测器:示 差 折 光 检 测
11、器。色 谱 柱:(.,)。流动相:娃哈哈纯净水。流速:.。柱温:。进样体积:。.红外光谱分析取研磨后的少量 粉末,置于 附件的金刚石晶体上,使用固体压杆将 粉末压平测量。测试方法:(金刚石晶体),检测器:,在 波数范围内扫描,扫描次数:次。.对斑马鱼增强免疫力作用研究.耐受性考察选用受精后 (,)的 系斑马鱼受精卵,经过脱膜处理,选择发育正常的斑马鱼幼鱼,置于 孔板中,每孔 尾,每组平行 孔。的浓度分别设置为.、.、.、.、.、.、.,同时设空白对照组(斑马鱼胚胎培养水处理幼鱼即可)。加盖置于 恒温光照培养箱中培养,记录给药 后斑马鱼形态及死亡情况,考察斑马鱼对 的耐受性。.斑马鱼免疫低下模型
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