黄芩汤、葛根芩连汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响_郑佳荟.pdf
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1、 年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 黄芩汤、葛根芩连汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响郑佳荟,李欢,赵重博,郭东艳,王晶,(陕西中医药大学秦药特色资源研究与开发国家重点实验室(培育)陕西省中药基础与新药研究重点实验室,陕西 咸阳;陕西中医药大学,陕西 咸阳)摘 要:目的 探讨黄芩汤、葛根芩连汤对溃疡性结肠炎()小鼠肠道菌群的调节作用。方法 采用 葡聚糖硫酸钠()水溶液自由饮用 建立 小鼠模型,同时连续 灌服不同剂量黄芩汤和葛根芩连汤,通过观察各组小鼠的体质量、疾病活动指数评分()、结肠长度及组织病理学来评价两种复方对 小鼠的疗效,采用 高通量测序探究黄芩汤、葛根芩连汤对 小
2、鼠肠道菌群的影响。结果 与模型组比较,黄芩汤中、高剂量组与葛根芩连汤中、高剂量组均显著改善了小鼠结肠组织病理学、体质量、评分、结肠长度。在肠道菌群方面,两种复方均能调节门水平上的拟杆菌门()、厚壁杆菌门()的相对丰度;在属水平上均能降低有害菌大肠杆菌志贺菌属()的相对丰度,其中,黄芩汤在增加有益菌乳杆菌属()、毛螺菌属()、肠杆菌属()的相对丰度上优于葛根芩连汤;葛根芩连汤在增加有益菌布劳特氏菌属()、降低有害菌变形菌门()的相对丰度上优于黄芩汤。结论 黄芩汤中剂量在改善体质量、评分、结肠长度方面优于葛根芩连汤不同剂量组,且两种复方可能通过调节肠道菌群平衡从而减轻 诱导的,其中,黄芩汤在调节有
3、益菌的数目上优于葛根芩连汤。关键词:黄芩汤;葛根芩连汤;葡聚糖硫酸钠;肠道菌群中图分类号:文献标识码:文章编号:():,(),;,):()(),(),基金项目:国家自然科学基金项目()通讯作者:王晶,博士,副教授。:陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 ,;,;,:;溃疡性结肠炎(,)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,与克罗恩病统称为炎症性肠病。的主要临床症状是腹泻、腹痛、体重减轻、便血等。已被世界卫生组织列为现代难治病之一。该病发病机制尚不清楚,但大量研究表明 与宿主基因、免疫系统紊乱、环境因素和肠道微生物影响有关。目前治疗 的常用药物包括美沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶、免疫抑制剂
4、、皮质类固醇等。然而,这些药物均有一定的副作用,如恶心,头痛和头晕。因此,临床上急需开发新的、有效安全并且毒副作用较低的药物治疗。中医虽未记载“溃疡性结肠炎”病名,但诸多医家根据其特征,将其归属为“肠澼”“下利”等范畴。应用中医药治疗 效果显著,历史悠久。黄芩汤记载于张仲景的伤寒论第 条:“太阳与少阳合病,自下利者,与黄芩汤;若呕者,黄芩加半夏生姜汤主之”。此方由黄芩三两、炙甘草二两、芍药二两、大枣十二枚组成,具有清热止痢、平肝敛阴、和中降逆的功效,在医方集解中黄芩汤被称为“万世治痢之祖”。此方虽仅含四味药,但其组方十分严谨,后世治疗痢疾的相关方剂也多半由此方演化而来,如芍药汤、黄芩芍药汤等,
5、可见其功效之奇。现代药理研究表明,黄芩汤对 具有确切的治疗作用,以调节免疫功能、抑制炎症反应、抗氧化应激、保护肠黏膜屏障等方面作用显著,且副作用较小。葛根芩连汤出自伤寒论第 条:“太阳病,桂枝证,医反下之,利遂不止,脉促者,表未解也。喘而汗出者,葛根黄芩黄连汤主之”。此方由葛根半斤,黄芩、黄连各三两,炙甘草二两组成,为治身热下痢之代表方,现代临床研究表明葛根芩连汤对 的治疗具有一定的疗效,改善其临床症状,且副作用小。目前,许多研究表明肠道微生物群是介导能量生产、营养供应、宿主防御和免疫发育等方面的重要因素。肠道微生物群失衡可导致免疫功能障碍,引起炎症甚至细胞凋亡,破坏肠道生理功能。因此,肠道微
6、生物群在人类的健康和疾病中发挥着重要作用。研究指出肠道微生物与 的发展有着密切的关系,在 患者及 小鼠的体内肠道微生物失衡主要表现为细菌多样性下降、益生菌的减少、致病菌增加。等观察到 患者及动物模型中肠道微生物群的一些常见变化,如厚壁菌门()的减少和变形菌门()的增加。有研究指出在给予乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌后,可以缓解 患者的炎症,。因此,调节肠道微生物群来改善 可能是一种新的治疗方法。黄芩汤与葛根芩连汤作为治疗 的经典良方,在各自治疗 上有何优势与不同,目前尚不清楚。因此,我们课题组从肠道菌群角度来分析黄芩汤和葛根芩连汤在治疗 上的优势和不同。材料和方法 实验材料 只 级 雄性小鼠(,年
7、龄 周)购自成都达硕实验动物有限公司,动物许可证号(川)。所有实 验 小 鼠 在 标 准 的 环 境 条 件 下 温 度 年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 (),相对湿度(),昼夜交替饲养,可以自由获得食物和无菌水。动物实验遵循陕西中医药大学实验动物管理和使用的规定,符合 原则。药物与试剂 黄芩汤的制备:分别称取黄芩,白芍、大枣、炙甘草各 ,加入 倍量水,浸泡 ,煎煮 后,趁热过滤药液;药渣加 倍量水继续煎煮 ,过滤,合并 次水煎液,浓缩至含生药质量浓度为 ,置于 保存。葛根芩连汤的制备:分别称取葛根,黄芩 ,黄连 ,炙甘草,加入 倍量水,浸泡,先煎葛根,水沸后煎煮 ,再和
8、余药共煎煮,趁热过滤药液;残渣加 倍量水,水沸后煎煮 ,合并 次水煎液,浓缩至含生药质量浓度为 ,置于 保存。所有中药饮片购于陕西兴盛德药业公司,经陕西中医药大学中药炮制教研室赵重博副教授鉴定为正品,符合 版中国药典一部相关规定;葡聚糖硫酸钠(,货号:)购于美国 公司,分子量 ;粪便隐血试纸,购自安徽深蓝医疗科技股份有限公司。仪器 型电子天平(德国 公司);正置光学显微镜、成像系统(日本尼康公司);包埋机(武汉俊杰电子有限公司);组织脱水机、病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)。方法 造模、分组与给药小鼠适应性喂养 后随机分成正常组()、模型组()、黄芩汤低、中、高剂量组(、,、),葛根芩连汤低
9、、中、高剂量组(、,、),共 组,每组 只。正常组饮用纯净水,其余 组连续 自由饮用 水溶液诱导小鼠 模型。在造模的同时,黄芩汤、葛根芩连汤给药组以灌胃的方式连续给药 。实验过程中根据实际消耗量每天新鲜配制 水溶液。小鼠的一般情况及 评分实验期间每天固定时间检测小鼠的的精神状态、毛发、体质量、粪便的性状及粪便便血程度。评分按照等方法进行,即 评分 (体质量下降分数 粪便性状分数 便血分数),见表。标本取材与制备 治疗第 收集各组小鼠新鲜粪便,并保存于 冰箱中。在第 时,各组小鼠被处以安乐死,收集结肠整段,同时记录结肠长度,取远端结肠 长的部分在 多聚甲醛中固定。表 疾病活动指数评分体重下降()
10、大便性状大便出血评分(分)正常正常()隐血阳性()松散轻微血便()肉眼血便()稀便显性出血()苏木精伊红()染色 结肠组织在 多聚甲醛中固定 以上,依次进行脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精伊红染色,最后在光学显微镜下观察结肠组织损伤情况。测序技术对样本中肠道菌群进行检测以及分析小鼠粪便样品 检测由北京诺禾致源科技股份有限公司完成,使用上游引物()和下游引物()对细菌的 段进行 扩增。产物经纯化、定量和均一化后,进行文库构建,构建好的文库经过 和 定量,文库合格后,使用 进行上机测序。统计学方法 所有定量数据以均数 标准差(),采用 软件进行数据分析与图形绘制,两组间比较采用 检验,多组间比较
11、采用单因素方差分析(),.为差异具有统计学意义。结果 两种复方对 小鼠一般性状及 的改善作用 一般状态观察实验期间,正常组小鼠状态良好、毛发光滑有光泽、饮食饮水量和粪便情况正常;与正常组比较,模型组小鼠自造模第 起,小鼠精神倦怠乏力、毛色黯淡无光泽、饮食饮水量减少、出现不同程度大便稀溏、便血情况。给药组经过黄芩汤和葛根芩连汤治疗后,小鼠精神状态出现明显好转,活动量增加,饮食饮水量也有所增加,粪便性状逐渐成形,便血情况也有所改善。小鼠的体重及疾病活动指数实验期间,正常组小鼠体质量呈上升趋势,模型组小鼠自造模第 起,体质量较正常组显著下降(陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 .
12、);黄芩汤中、高剂量组,葛根芩连汤中、高剂量组小鼠较模型组小鼠体质量均有明显改善()(图)。评分显示,与正常组比较,模型组自第 起 评分显著升高(),黄芩汤中、高剂量组与葛根芩连汤中、高剂量组 评分降低();其中,黄芩汤中剂量效果优于葛根芩连汤中、高剂量组(图)。注:黄芩汤低、中、高剂量组与葛根芩连汤低、中、高剂量组对小鼠体质量变化的影响;黄芩汤低、中、高剂量组与葛根芩连汤低、中、高剂量组对小鼠疾病活动指数()评分;与正常组比较,.,;与模型组比较,图 小鼠体重及疾病活动指数 两种复方治疗 小鼠后结肠长度及组织病理学观察 结肠长度变化与正常组比较,模型组小鼠结肠长度显著缩短();与模型组比较,
13、黄芩汤中、高剂量组与葛根芩连汤中剂量组均具有统计学意义()(图),其中以黄芩汤中剂量效果最好。结肠组织病理学观察 正常组小鼠肠壁粘膜上皮细胞完整、无溃疡,固有层无炎细胞浸润,其它各层未见明显病变。与正常组相比,模型组小鼠大量炎症细胞浸润至结肠粘膜下层,隐窝缺失、表面可见变性坏死不完整的上皮细胞。与模型组比较,黄芩汤低、中、高剂量组、葛根芩连汤低、中、高剂量组均有不同程度的改善。其中,黄芩汤中、高剂量与葛根芩连汤中、高剂量有减轻肠壁粘膜炎症和溃疡的作用(图)。注:与正常组比较,;与模型组比较,。图 各组小鼠结肠长度注:正常组;模型组;黄芩汤低剂量组;黄芩汤中剂量组;黄芩汤高剂量组;葛根芩连汤低剂
14、量组;葛根芩连汤中剂量组;葛根芩连汤高剂量组图 各组 小鼠结肠组织病理切片结果(,)年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 两种复方治疗 小鼠后肠道菌群测序结果 物种注释与评估 为了评估测序物种的深度和丰富度,稀疏化处理了每个样本。群落覆盖度()稀释曲线分析结果可见(图),随着测序量的增加,曲线趋于平坦,表明测序深度足够,大部分菌群已被检测到。小鼠肠道菌群的主坐标分析()是一种非约束性的数据降维分析方法,可用来研究样本群落组成的相似性或差异性。本研究通过 做图发现正常组与模型组菌群样本分布在不同区域,提示两组肠道菌群结构存在差异性,同组样品分布在相近区(图)。给药后,黄芩汤低、中
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