单增李斯特菌前噬菌体的分布及遗传特征分析_纪顺师.pdf
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1、*实验研究*单增李斯特菌前噬菌体的分布及遗传特征分析纪顺师1,王艳1,宋泽萱1,毛盼1,李玲玲1,陈晋妮1,刘凌云1,2,孙晖1,罗霞1,叶长芸1摘要:目的了解单增李斯特菌基因组中前噬菌体分布状况和基因组特征。方法自公共数据库 GenBank 获得 275 株单增李斯特菌的全基因组序列,运用前噬菌体在线预测软件(PHASTER)对其携带的前噬菌体进行预测。并对预测的完整前噬菌体进行聚类分析、插入位点识别、噬菌体整合酶多态性分析。此外,通过比对耐药基因和毒力基因数据库,搜寻前噬菌体可能携带的耐药基因和毒力基因。结果本研究发现 99.3%的单增李斯特菌基因组含有前噬菌体序列,155 株(56.4%
2、)单增李斯特菌基因组预测到 229 个完整前噬菌体序列。所有完整前噬菌体聚集成 4 个群,进一步划分为 10 个簇。前噬菌体分群与其宿主菌所属家系具有较强的相关性,但与宿主菌来源无关。本研究识别到 10 个前噬菌体插入位点,其中 lmot17(tRNAArg),lmot11(tRNASer)和 comK 是 3 个最常见的插入位点,lmo1263 为新发现的插入位点。相同插入位点前噬菌体所携带整合酶氨基酸序列高度相似。此外,研究发现部分家系菌株和 1 株家系菌株的噬菌体中携带毒力相关蛋白 E 编码基因(virE),所有完整前噬菌体中未发现耐药基因。结论单增李斯特菌普遍携带前噬菌体,超过半数的菌
3、株携带完整前噬菌体,其基因组具有多样性,且在宿主菌染色体中具有多个插入位点。这些插入位点与噬菌体所携带整合酶氨基酸序列密切相关。此外,未发现前噬菌体中携带耐药基因。关键词:单增李斯特菌;前噬菌体;插入位点;整合酶中图分类号:R211;R378文献标志码:A文章编号:10039961(2023)05052908DistributionandgeneticcharacterizationofListeriamonocytogenesprophagesJi Shunshi1,Wang Yan1,Song Zexuan1,Mao Pan1,Li Lingling1,Chen Jinni1,Liu Li
4、ngyun1,2,Sun Hui1,Luo Xia1,Ye Changyun1.1.State Key Laboratory of InfectiousDisease Prevention and Control,National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center forDisease Control and Prevention,Beijing 102206,China;2.Department of Microbiology,School of Basic Medicine,Gu
5、izhouMedical University,Key Laboratory of Pathogenic Biology in Guizhou Province,Guiyang 550025,Guizhou,ChinaCorresponding authorCorresponding author:Ye Changyun,Email:Abstract:ObjectiveThisstudyaimstoinvestigatethedistributionandgenomiccharacteristicsoftheprophagesinListeria monocytogenes.Methods27
6、5Listeria monocytogenesgenomeswereselectedandusedtopredictprophagesbyprophagepredictionsoftware(PHASTER).Thecompleteprophageswerealsosubjectedtoclusteringanalysis,insertionsiteidentificationandprophageintegrasepolymorphismanalysis.Inaddition,theprophagesweresearchedforpossibledrugresistancegenesandv
7、irulencegenescarriedbycomparingthedrugresistancegeneandvirulencegenedatabase.ResultsInthisstudy,99.3%ofListeria monocytogenescarriedprophages,and155strains(56.4%)werepredictedtohave229completeprophages,whichweredividedinto4groupsand10clusters.Prophagegroupswerecorrelatedwithstrainlineages,butnotwith
8、strainorigins.Tenprophageinsertionsiteswereidentifiedinthisstudy,amongwhichlmot17(tRNAArg),lmot11(tRNASer)andcomKwerethethreemostcommoninsertionsites,andlmo1263wasanewlyidentifiedinsertionsite.Theaminoacidsequencesofintegrasescarriedbytheprophagesinsameinsertionsitehadhighsimilarity.Inaddition,thege
9、necodingforvirulence-associatedproteinE(virE)wasfoundintheprophageofsomelineagestrainsandonelineagestrain,andnodrugresistancegenewasfoundinallintactprophages.ConclusionListeria monocytogenescommonlycarriedprophages,morethanhalfofthestrainscarryinganintactprophagewithadiversegenomeandmultipleinsertio
10、nsitesinthehostbacteriumchromosome.Theseinsertionsitesareassociatedwithintegraseaminoacidsequencescarriedbytheprophage.Inaddition,noantibioticresistancegeneswerefoundinprophagesinListeria monocytogenes.Keywords:Listeria monocytogenes;Prophage;Insertionsite;IntegraseThisstudywassupportedbytheNational
11、InstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention(No.2021ZZKT003)噬菌体是一类能天然感染细菌、真菌和放线菌等微生物的病毒。噬菌体在自然环境中广泛分布,基金项目:中国疾病预防控制中心传染病所自主课题(No.2021ZZKT003)作者单位:1.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病国家重点实验室,北京102206;2.贵州医科大学基础医学院微生物学教研室,贵州省病原生物学特色重点实验室,贵州贵阳550025作者简介:纪顺师,男,山东省青
12、岛市人,博士研究生,主要从事单增李斯特菌基因组分析工作,Email:通信作者:叶长芸,Tel:01058900749,Email:收稿日期:20230328网络出版日期:20230515疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5529www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202303280127据估计数量高达 4.810311。根据感染结局不同分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体通过吸附宿主菌,注入遗传物质到宿主内,利用宿主合成、组装子代噬菌体,最后裂解宿主并释放子代噬菌体。温和噬菌体也称
13、为溶源性噬菌体,其感染细菌后并不增殖,而是将核酸整合至宿主染色体中,并伴随宿主染色体的复制而复制,整合到宿主染色体上的温和噬菌体核酸被称为前噬菌体。早在 1940 年,就有关于单增李斯特菌特异性噬菌体的报道,迄今已发现和分离了超过 500 种单增李斯特菌噬菌体,其中 70%以上属于溶源性噬菌体2。目前发现的单增李斯特菌特异的噬菌体都属于有尾噬菌体目,包括长尾噬菌体科(如噬菌体A118 和 PSA,基因组大小一般在 3065kb 之间)、肌尾噬菌体科(如噬菌体 A511 和 P100,基因组大小在 125140kb 之间),且遗传物质主要为双链DNA2,至今未发现短尾噬菌体科噬菌体。前噬菌体在单
14、增李斯特菌基因组中广泛存在,王旭等3报道了一株单增李斯特菌携带 5 个前噬菌体。噬菌体编码的整合酶介导噬菌体基因组整合到宿主染色体中,并且介导在诱导条件下(如紫外线照射或丝裂霉素 C 处理)噬菌体基因组的切除。根据催化作用氨基酸残基的不同,噬菌体整合酶分为酪氨酸型整合酶和丝氨酸型整合酶4。噬菌体A118 编码丝氨酸型整合酶,它识别噬菌体和细菌附着位点之间 3bp 同源序列。噬菌体 PSA 编码酪氨酸型整合酶,识别噬菌体和细菌附着位点之间 15bp同源序列。tRNA 被认为是单增李斯特菌前噬菌体插入的锚定元件,如噬菌体 B025 和 PSA 整合在tRNAArg基因座中5。目前已报道的单增李斯特
15、菌前噬菌体插入位点有 tRNAArg、tRNALys、tRNASer、tRNALeu、tRNAThr、comK 基因、核糖体蛋白 S9 编码基因、EF-Ts 转录延长因子编码基因下游和 fosX 基因下游58。前噬菌体能介导外源基因的水平转移,是细菌获得外源性遗传物质(如毒力基因、抗性基因和耐药基因)的重要方式。前噬菌体编码毒力因子导致细菌致病性增强在多种致病菌中均有报道,如霍乱弧菌噬菌体 CTX 编码霍乱毒素 CTX,大肠埃希菌噬菌体 H19-B 和 933W 编码志贺样毒素 Stx-1和 Stx-2,白喉棒状杆菌 噬菌体编码 DT 毒素9。在单增李斯特菌中,Rabinovich 等10报道
16、了一些携带前噬菌体 comK(插入位点为 comK 基因内的前噬菌体)的单增李斯特菌被巨噬细胞吞噬后,进入吞噬小体,前噬菌体 comK 会被激活并从宿主基因组中剪切下来,使得 comK 基因生物学功能得以恢复,从而帮助宿主菌逃离出吞噬小体,至今尚未发现前噬菌体携带的基因影响单增李斯特菌致病性及毒力的证据。此外,我们之前研究发现插入位点为 fosX 基因下游的前噬菌体能介导氨基糖苷类抗性基因(aacA4)在ST3 型单增李斯特菌中传播11。前噬菌体在单增李斯特菌中广泛存在,关于其在单增李斯特菌中的分布特征、插入位点和整合酶氨基酸序列多样性、毒力和耐药基因携带情况鲜有报道。本研究通过基因组信息分析
17、,旨在探究单增李斯特菌前噬菌体分布和基因组特征,为进一步了解单增李斯特菌前噬菌体整合机制、单增李斯特菌的基因组多态性及其生物防治提供参考依据。1材料与方法1.1菌株选择通过 NCBIGenome 数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下载单增李斯特菌全基因组完成图序列 359 条(截至日期为 2022 年9 月)。除去部分背景信息(时间、地区、来源)相同的菌株,本研究共纳入 275 株单增李斯特菌基因组用于前噬菌体分析。1.2菌株分子分型使用巴斯德研究所网站(https:/bigsdb.pasteur.fr/)线上工具,根据单增李斯特菌 7 个管家基因
18、进行多位点序列分型(Multilocussequencetyping,MLST),确定菌株的家系和克隆复合群(Clonalcomplex,CC)。1.3前噬菌体预测利用前噬菌体在线预测软件Phage Search Tool Enhanced Release(PHASTER,https:/phaster.ca/)对单增李斯特菌基因组中携带的前噬菌体进行预测。根据得分结果,分为完整前噬菌体(得分90 分),疑似前噬菌体(得分 7090 分之间)和不完整前噬菌体(得分70)三类。使用MAUVE 软件将携带完整前噬菌体的菌株基因组与单增李斯特菌参考菌株 EGD-e(NC_003210)进行共线性分析,
19、获得完整前噬菌体的基因组序列,并对其进行后续分析。1.4前噬菌体序列聚类分析使用 fastANI(https:/ 和 PSA 的基因组序列A006(accession no.NC_009815.1)、A118(NC_003216.1)、A500(NC_009810.1)、B025(NC_009812.1)、B054(NC_009813.1)和PSA(NC_003291.2)作为参照。利用 R 软件包factoextra 中的 hclust 对 fastANI 计算的相似度矩阵结果进行分层聚类分析,采用默认的最长距离法(complete)建树。聚类树使用 iTOL 网站(https:/530疾病
20、监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202303280127itol.embl.de/)进行可视化修饰。1.5前噬菌体插入位点分析单增李斯特菌参考菌株 EGD-e 仅携带一个完整前噬菌体,即 comK,通过 MAUVE 软件绘制各菌株与 EGD-e 基因组共线性分析图,以确定除 comK 插入位点之外其他前噬菌体的插入位点。完整的 comK 基因全长为 609bp,通过本地化 BLAST 比对,若基因组中含全长comK 基因,则该位点未插入前噬菌体,否
21、则证明该位点有前噬菌体插入。1.6前噬菌体整合酶分析从 NCBIGenome 数据库下载菌株的注释文件,从中提取整合酶氨基酸序列。使用 ClustalOmega(https:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在线多序列比对软件聚类,并采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)对单增李斯特菌前噬菌体整合酶氨基酸序列构建进化树。1.7前噬菌体携带毒力和耐药基因分析耐药基因分析采用 Abricate 工具(https:/ CARD耐药基因数据库,基因覆盖度和一致性的阈值均设置为 80%。毒力因子通过比对毒力因子数据库(VFDB)和检索菌株的注释文件中噬菌
22、体编码蛋白功能获得。2结果2.1研究菌株的基本特征275 株单增李斯特菌分离自 18 个国家,4 种不同来源(食品、患者、动物和环 境),时 间 跨 度 为 1924 2020 年(附 表 1,http:/www.jbjc.org/article/doi/10.3784/jbjc.202303280127)。采用 MLST 分型方法,275 株单增李斯特菌分 为 90 个 序 列 型(sequence types,STs),61 个CC 群和 4 个家系。家系和的菌株数量较多,分别为 109 株和 149 株,家系菌株有 14 株,家系菌株只有 3 株(附表 1,http:/www.jbjc.
23、org/article/doi/10.3784/jbjc.202303280127)。2.2前噬菌体预测275 株单增李斯特菌全基因组序列中仅有两株(家系和菌株各 1 株)没有预测到前噬菌体,其余 273 株(99.3%)分别携带 17 个数量不等的前噬菌体,共计 760 个,菌株平均携带2.78 个前噬菌体(附表 1,http:/www.jbjc.org/article/doi/10.3784/jbjc.202303280127)。预测为完整前噬菌体 229 个,疑似前噬菌体和不完整前噬菌体分别为 332 个和 199 个。菌株平均携带 0.84 个完整前噬菌体。155 株菌(56.4%)携
24、带完整前噬菌体,其中携带 1、2、3、4 个完整前噬菌体的菌株分别为 100 株、39 株、13 株和 3 株。完整前噬菌体大小在 32.1kb57.4kb 之间,编码 4180 个蛋白,(G+C)%含量在33.3%42.2%之间(附表2,http:/www.jbjc.org/article/doi/10.3784/jbjc.202303280127)。家系和家系菌株平均携带 0.84 个和 0.85 个完整前噬菌体,两者差异无统计学意义。2.3前噬菌体序列聚类分析前噬菌体分层聚类分析表明,229 个完整的前噬菌体序列和 6 个单增李斯 特 菌 噬 菌 体 参 考 序 列 聚 为 4 个 群(
25、Group,G1G4),G1 和 G2 群前噬菌体主要来源于单增李斯特菌家系菌株,G3 和 G4 群前噬菌体主要来源于单增李斯特菌家系 I 菌株,前噬菌体聚类结果与菌株来源无关(图 1)。4 个群可进一步分为 10 个簇(Clade,ClC10),G1 群包含 C1C3 簇,G2 群对应C4 簇,G3 群包含C5C7 簇,G4 群包含C8C10 簇。其中,C3、C4 和 C10 簇包含的前噬菌体数量最多,分别为 63、39 和 42 个。6 株噬菌体参考株 PSA 位于 C1 簇,B025 位于 C3 簇,B054 位于 C5 簇,A600位于 C9 簇,A118 和 A500 位于 C10
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